Эмиль фон Беринг

Антиген - вещества, способные вызывать иммунный ответ, выработку антител.

Классификация по происхождению: естественные АГ, искусственные АГ; АГ, полученные в результате ГМ естественных АГ; синтетические АГ.

По химическому составу – это 1)белки. Минимум, 8 АК. Но всё, что меньше 20 АК вызывает иммунную реакцию с очень низкой вероятностью. 2)углеводы. 3)НК. 4) некоторые липиды – стероиды НП, холестерин, а вот триглицериды (сильно биполярные) – оч плохие АГ, к ним АТ не вырабатываются.

По отношениям пары донор-реципиент: 1) ауто-АГ (своего организма), 2)изо-АГ (от генетически-идентичной особи: клон или близнец), 3)алло-АГ (того же вида)вероятность такого контакта у взрослого человека в природных условиях крайне мала, встречается, например, при переливании крови. У колониальных асцидий – легко4)ксено-АГ(другого вида) – всё остальное! – мыши, коровы, вирусы, бактерии. Итого, самое интересно – это ауто- и ксено-АГ.

Антигенность – мера антигенного качества, способность вызывать большую или меньшую продукцию АТ.

Иммуногенность – это способность создавать состояние иммунитет, т.е.е невосприимчивости организма при повторном контакте с антигеном.

Самый яркий пример, когд а2 эти свойства не совпадают – это сальмонелла. Продукция АТ огромна, а вот иммунитет против неё не вырабатывается. +ИППП (инф, передающиеся половым путем).

Иммуногенность связана с наличием на поверхности АГ т.н. антигенных детерминант (=эпитопов).

Г-н Карл Ландштейнер (NP1930г). Опыт:

МАБС – метааминобензолсулфонат – вводили мышам – не было никакого эффекта.

МАБС сшили с белком овальбумуном – ввели мышам – получили два типа антител: к овальбумину и к МАБС.

Термины: «гаптен» и «носитель». Гаптен – маленькая группировка, с которой происходит связывание АТ, тут и возникло понятие эпитопа. Итак, чем больше размер и чем большую гетерогенность имеет молекула АГ, тем сильнее будет ответ. Т.е иммунный ответ вызывается не всей молекулой, а определенными группировкам на её поверхности.

Другой опыт Ландштейнера:

Пришивал боковые группировки в разные позиции МАБС (орто/мета/пара)

Мышь иимунизировали конъюгатом овальбумин-МАБС. А проявлял АТ, вводя разные вещества (см.таблицу). Самое сильное связывание – в мета-положении.

Показано, что АТ специфичны к очень маленькой группировке, которая достаточно точно соответствует структуре паратопа (АГ-распознающего участка). Так, размер этой группировки (эпитопа) оч небольшой. Разные участки одной молекулы могут выполнять функции и носителя, и гаптена.

Пространственные (или криптальные) АГ.

Молекулы Антител состоят из двух белковых цепей: тяжелой и легкой. Они относятся к фракции γ-глобулинов сыворотки крови.

Портер и Эдельман, 1960е. Определили АК, нуклеотидную последовательности. Построили модели с помощью рентгено-структурного анализа. Показали, что ИГ состоит из двух тяжелый Н и двух легкий цепей L. Цепи состоят из ИГ-доменов, внутри каждого домена альфа-спиральные бета-складчатые участки, и в каждом домене есть как минимум одна дисульфидная связь. Тяж и легкие цепи связаны двумя дисульфидными связями, а тяжелые цепи между собой связаны переменным числом дисульфидных связей. Место соединения Л и Т цепей – шарнирный участок.

Изменениям подвержены только вариабельные участки VHиVL.

Типы тяжелых цепей: (в порядке открытия)

γ-цепь – IgG(4 домена)

μ – IgM(5доменов)

α – IgA(4 домена)

δ – IgD(4 домена)

ε – IgE (5 домена)

Связывание компонентов С’ происходит между 2 и 3м доменами. С С2-доменом IgGсвязаны сайты гликозилирования – эта зона шарнирного участка прикрывается. Наличие углеводного компонента приводит к вариабельности массы различных антител с разницей до 30кДа.

Несколько конформаций структуры паратопа.

Pocket– распознавание пептидов, длиной максимум 7 АК, обычно = 3-5АК.

• Расширенная поверхность (например, распознавание лизоцима)

  Исходно все эти три модели были выведены математически – а позже подтверждены экспериментально.

(картинка)

CDR–Complementarydeterminedregion– участки, определяющие комплементарность – термин касается зоны соприкосновения с АГ. В пределахCDRмогут меняться разные кусочки. Так, на тяжелой цепи триCDR, на легкой – два. Т.е. меняется не весь антиген, а только эти участки (на уровне гена - гипермутации).

Работы Ландштайнера, Полинга

Инструктивная теория – механизм образования специфических антител обусловлен инструктивным действием антигенов. Развивались с 1900 по 1940 годы. Сложилось убеждение, что именно антиген управляет образованием специфических антител, направляя механизмы белкового синтеза на изготовление тех уникальных молекулярных конфигурации, которые определяют иммунологическую специфичность. Тем или иным способом антиген должен передать новообразованной молекуле белка информацию о своей специфичности, чтобы придать этой молекуле функции антитела.

Работа Ф. Брейнлема

Наиболее известная из этих инструктивных теорий, созданная в 1930 г. Ф. Брейнлем и Ф. Гауровицем (F. Breinl, F. Haurowitz), утверждала, что антиген играет роль матрицы, которая обеспечивает сборку уникальных аминокислотных последовательностей полипептидной цепи антител. Позднее инструктивная теория была развита Лайнусом Полингом (Linus Pauling), поддержавшим ее всем авторитетом, которым он пользовался в области физической химии. Утверждалось, что антиген может служить тем шаблоном, на котором происходит свертывание предобразованной полипептидной цепи с возникновением соответствующей третичной конфигурации, заключающей в себе стереохимическую специфичность. В течение нескольких десятилетий подобные теории прямой матрицы пользовались большой популярностью, так как казалось, что они предлагают единственное разумное объяснение тому многообразию антител, которое, как показали Ландштейнер (Landsteiner) и другие, может образовываться в организме позвоночных.

Не будь антитела, не сформируются вариации к нему. В течение нескольких десятилетии подобные теории пользовались популярностью, так как казалось, что они предлагают 1 разумное объяснение тому разнообразию антител, которое, как показал Ландштейнер, может образовываться в организме позвоночных. Но биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигенов и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный ответ. Эти теории совсем не могли объяснить, почему при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к снижению специфичности, а в других – к значительному расширению. С точки зрения биологии, теории матрицы обладали недостатками, что и привело вирусолога Бернета к созданию в 1941 году другого варианта инструктивной теории. Он предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые не обходимо для синтеза глобулина, вызывая в результате образования уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов объясняла не только широту иммунологического репертуара, но длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела.

Однако, исходя из этих химических теорий, биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигена, и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный (бустерный) ответ. Более того, эти теории совсем не могли объяснить последних данных о том, что при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к сужению специфичности, а в других - к значительному расширению диапазона перекрестных серологических реакций.

С развитием представлений о возможной генетической роли НК Бернет и Феннер в 1949 году предложили модификацию этой теории: антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном. Это приводит затем к образованию не прямой матрицы для специфических антител. Новая копию гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.

С точки зрения биолога, теории матрицы обладали значительными недостатками, и именно это привело вирусолога Макфарлейна Бернета (Macfarlane Burnet) к созданию в 1941 г. другого варианта инструкционистской теории. В условиях растущего признания той роли, которую ферменты играют в процессах синтеза и расщепления, Бернет предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые необходимы для синтеза глобулина, вызывая в результате образование уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов имела то преимущество, что с позиций первичной инструктивной роли антигена она объясняла не только широту иммунологического репертуара, но и длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела. Этот последний момент имеет особое значение, поскольку Бернет (Burnet) является, по-видимому, первым, кто подчеркнул важную роль длительного функционирования клеток и клеточной пролиферации в процессе образования антител.

С развитием представлений о возможной генетической роли нуклеиновых кислот Бернет и Франк Феннер (Burnet, Frank Fenner) в 1949 г. предложили модификацию этой теории, по-прежнему исходя из биологических соображений. На этот раз они предположили, что антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном (РНК). Это приводит затем к образованию непрямой матрицы для специфических антител. Новая копия гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.

АНТИТЕЛА - белки глобулиновой фракции сыворотки крови человека и теплокровных животных, образующиеся в ответ на введение в организм различных антигенов (бактерий, вирусов, белковых токсинов и др.) и специфически взаимодействующие с антигенами, вызвавшими их образование. Связываясь активными участками (центрами) с бактериями или вирусами, антитела препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества. Наличие в крови антител указывает на то, что организм вступал во взаимодействие с антигеном против вызываемой им болезни. В какой степени иммунитет зависит от антител и в какой степени антитела только сопутствуют иммунитету, решается применительно к конкретной болезни. Определение уровня антител в сыворотке крови позволяет судить о напряженности иммунитета даже в тех случаях, когда антитела не играют решающей защитной роли.

Защитное действие антител, содержащихся в иммунных сыворотках, широко используется в терапии и профилактике инфекционных заболеваний (см. Серопрофилактика , Серотерапия). Реакции антител с антигенами (серологические реакции) применяют в диагностике различных заболеваний (см. Серологические исследования).

История

На протяжении длительного времени о хим. природе А. знали очень немного. Известно, что антитела после введения антигена обнаруживаются в сыворотке крови, лимфе, экстрактах тканей и что они специфически реагируют со своим антигеном. О наличии антител судили на основании тех видимых агрегатов, которые образуются при взаимодействии с антигеном (агглютинация, преципитация) или по изменению свойств антигена (нейтрализация токсина, лизис клетки), но о том, с каким химическим субстратом антител связаны, почти ничего не было известно.

Благодаря применению методов ультрацентрифугирования, иммуно-электрофореза и подвижности белков в изоэлектрическом поле доказана принадлежность антител к классу гамма-глобулинов, или иммуноглобулинов.

Антитела представляют собой преформированные в процессе синтеза нормальные глобулины. Иммунные глобулины, полученные в результате иммунизации различных животных одним и тем же антигеном и при иммунизации одного и того же вида животного различными антигенами, обладают неодинаковыми свойствами, так же как неодинаковы сывороточные глобулины различных видов животных.

Классы иммуноглобулинов

Иммуноглобулины вырабатываются иммунокомпетентными клетками лимфоидных органов, различаются между собой по мол. весу, константе седиментации, электрофоретической подвижности, содержанию углеводов и иммунологической активности. Различают пять классов (или типов) иммуноглобулинов:

Иммуноглобулины М (IgM) : молекулярный вес около 1 млн., имеют сложную молекулу; первыми появляются после иммунизации или антигенной стимуляции, оказывают губительное действие на микробы, которые попали в кровь, способствуют их фагоцитозу; слабее, чем иммуноглобулины G, связывают растворимые антигены, токсины бактерии; разрушаются в организме в 6 раз быстрее, чем иммуноглобулины G (например, у крыс период полураспада иммуноглобулина М равен 18 часам, а иммуноглобулина G - 6 дням).

Иммуноглобулины G (IgG) : молекулярный вес около 160 000, их считают стандартными, или классическими, антителами: легко проходят через плаценту; образуются медленнее, чем IgM; наиболее эффективно связывают растворимые антигены, особенно экзотоксины, а также вирусы.

Иммуноглобулины А (IgA) : молекулярный вес около 160 000 или больше, вырабатываются лимфоидной тканью слизистых оболочек, препятствуют деградации ферментов клеток организма и противостоят патогенному действию микробов кишечника, легко проникают через клеточные барьеры организма, содержатся в молозиве, слюне, слезах, слизи кишечника, поте, отделяемом носа, в крови находятся в меньшем количестве, легко соединяются с клетками организма; IgA возникли, по-видимому, в процессе эволюции для защиты слизистых оболочек от агрессии бактериями и передачи пассивного иммунитета потомству.

Иммуноглобулины Е (IgE) : молекулярный вес около 190 000 (по Р. С. Незлину, 1972); по-видимому, ими являются аллергические антитела -так называемые реагины (см. ниже).

Иммуноглобулины D (IgD ): молекулярный вес около 180 000 (по Р. С. Незлину, 1972); в настоящее, время о них известно очень мало.

Структура антител

Молекула иммуноглобулина состоит из двух неидентичных полипептидных субъединиц - легких (L - от английского light) цепей с молекулярным весом 20 000 и двух тяжелых (Н - от английского heavy) цепей с молекулярным весом 60 000. Эти цепи, связанные дисульфидными мостиками, образуют основной мономер LH. Однако в свободном состоянии такие мономеры не встречаются. Большая часть молекул иммуноглобулинов состоит из димеров (LH) 2 , остальные - из полимеров (LH) 2n . Основными N-концевыми аминокислотами человеческого гамма-глобулина являются аспарагиновая и глутаминовая, кроличьего - аланин и аспарагиновая кислота. Портер (R. R. Porter, 1959), воздействуя на иммуноглобулины папаином, нашел, что они распадаются на два (I и II) Fab-фрагмента и Fc-фрагмент (III) с константой седиментации 3,5S и молекулярным весом около 50 000. Основная масса углеводов связана с Fc-фрагментом. По предложению экспертов ВОЗ установлена следующая номенклатура фрагментов антител: Fab-фрагмент - одновалентный, активно соединяющийся с антигеном; Fc-фрагмент - не взаимодействует с антигеном и состоит из С-концевых половин тяжелых цепей; Fd-фраг-мент - участок тяжелой цепи, входящий в Fab-фрагмент. Фрагмент пепсинового гидролиза 5S предложено обозначать как F(ab) 2 , а одновалентный 3,5S-фрагмент - Fab.

Специфичность антител

Одним из важнейших свойств антител является их специфичность, которая выражается в том, что антитела активнее и полнее взаимодействует с тем антигеном, которым организм был стимулирован. Комплекс антиген - антитело в этом случае обладает наибольшей прочностью. Антитела способны различать в антигенах незначительные изменения в структуре. При использовании конъюгированных антигенов, состоящих из белка и включенного простого химического вещества - гаптена, образующиеся антитела специфичны к гаптену, белку и комплексу белок - гаптен. Специфичность обусловлена химической структурой и пространственным рисунком антидетерминант антител (активных центров, реактивных групп), то есть участков антител, которыми они соединяются с детерминантами антигена. Число антидетерминант антител часто называют их валентностью. Так, молекула IgM-антитела может иметь до 10 валентностей, молекулы IgG- и IgA-антител двухвалентны.

По данным Караша (F. Karush, 1962), активные центры IgG состоят из 10-20 аминокислотных остатков, что составляет примерно 1 % всех аминокислот молекулы антител, а, по представлениям Уинклера (М. Н. Winkler, 1963), активные центры состоят из 3-4 аминокислотных остатков. В их составе найдены тирозин, лизин, триптофан и др. Антидетерминанты расположены, очевидно, в аминоконцевых половинах Fab-фрагментов. В образовании активного центра участвуют вариабельные отрезки легких и тяжелых цепей, причем последним принадлежит основная роль. Возможно, легкая цепь лишь частично участвует в формировании активного центра или стабилизирует структуру тяжелых цепей. Наиболее полноценная антидетерминанта создается лишь комбинацией легких и тяжелых цепей. Чем больше точек совпадения связи между антидетерминантами антител и детерминантами антигена, тем выше специфичность. Разная специфичность зависит от последовательности аминокислотных остатков в активном центре антител. Кодирование огромного разнообразия антител по их специфичности неясно. Портер допускает три возможности специфичности .

1. Образование стабильной части молекулы иммуноглобулина контролируется одним геном, а вариабельной части - тысячами генов. Синтезированные пептидные цепи соединяются в молекулу иммуноглобулина под влиянием особого клеточного фактора. Антиген в этом случае выступает в качестве фактора, запускающего синтез антител.

2. Молекула иммуноглобулина кодируется стабильными и изменчивыми генами. В период клеточного деления происходит рекомбинация изменчивых генов, что и обусловливает разнообразие их и вариабельность участков молекул глобулинов.

3. Ген, кодирующий вариабельную часть молекулы иммуноглобулинов, повреждается особым ферментом. Другие ферменты восстанавливают повреждение, но вследствие ошибок допускают различную последовательность нуклеотидов в пределах данного гена. Этим и обусловлена различная последовательность аминокислот в вариабельной части молекулы иммуноглобулина. Имеются и другие гипотезы, напр. Бернета (F. М. Burnet, 1971).

Гетерогенность (неоднородность) антител проявляется по многим признакам. В ответ на введение одного антигена образуются антитела, различающиеся по сродству к антигену, антигенным детерминантам, молекулярному весу, электрофоретической подвижности, N-концевым аминокислотам. Групповые антитела к различным микробам обусловливают перекрестные реакции к разным видам и типам сальмонелл, шигелл, эшерихий, животных белков, полисахаридов. Продуцируемые антитела неоднородны по своей специфичности относительно гомогенного антигена или одной антигенной детерминанты. Гетерогенность антител отмечена не только против белковых и полисахаридных антигенов, но и против комплексных, в том числе конъюгированных, антигенов и против гаптенов. Полагают, что гетерогенность антител определяется известной микрогетерогенностью детерминант антигена. Гетерогенность может быть вызвана образованием антител на комплекс антиген - антитело, что наблюдается при многократной иммунизации, различием клеток, образующих антител, а также принадлежностью антител к разным классам иммуноглобулинов, которые, как и другие белки, обладают сложной антигенной структурой, контролируемой генетически.

Виды антител

Полные антитела имеют не менее двух активных центров и при соединении с антигенами in vitro обусловливают видимые реакции: агглютинацию, преципитацию, связывание комплемента; нейтрализуют токсины, вирусы, опсонизируют бактерии, обусловливают визуальный феномен иммунного прилипания, иммобилизации, набухания капсул, нагрузки тромбоцитов. Реакции протекают в две фазы: специфическая (взаимодействие антитела с антигеном) и неспецифическая (тот или иной из вышеуказанных феноменов). Общепризнано, что различные серологические реакции обусловливаются одним, а не множеством антител и зависят от методики постановки. Различают тепловые полные антитела, реагирующие с антигеном при t° 37°, и холодовые (криофильные), проявляющие эффект при t° ниже 37°. Имеются также антитела, реагирующие с антигеном при низкой температуре, а видимый эффект проявляется при t° 37°; это двухфазные, биотермические антитела, к которым отнесены гемолизины Доната - Ландштейнера. Все известные классы иммуноглобулинов содержат полные антитела. Активность и специфичность их определяются титром, авидностью (см. Авидитет), числом антидетерминант. IgM-антитела более активны, чем IgG-антитела, в реакциях гемолиза и агглютинации.

Неполные антитела (непреципитирующие, блокирующие, агглютиноиды), как и полные антитела, способны соединяться с соответствующими антигенами, но реакция при этом не сопровождается видимым in vitro феноменом преципитации, агглютинации и др.

Неполные антитела обнаружены у человека в 1944 году к резус-антигену, их находили при вирусных, риккетсиозных и бактериальных инфекциях по отношению к токсинам при различных патологических состояниях. Существует ряд доказательств двухвалентности неполных антител. Бактериальные неполные антитела обладают защитными свойствами: антитоксическими, опсонизирующими, бактериологическими; вместе с тем неполные антитела обнаружены при ряде аутоиммунных процессов - при заболеваниях крови, особенно гемолитических анемиях.

Неполные гетеро-, изо- и аутоантитела способны вызвать повреждение клеток, а также играть определенную роль в возникновении медикаментозных лейко- и тромбоцитопении

Нормальными (естественными) принято считать антитела, обычно встречающиеся в сыворотке крови животных и человека при отсутствии явной инфекции или иммунизации. Происхождение антибактериальных нормальных антител может быть связано, в частности, с антигенной стимуляцией нормальной микрофлорой организма. Эти взгляды теоретически и экспериментально обоснованы исследованиями на животных-гнотобионтах и новорожденных в обычных условиях обитания. Вопрос о функциях нормальных антител связан непосредственно со специфичностью их действия. Л. А. Зильбер (1958) полагал, что индивидуальная устойчивость к инфекциям и, кроме того, «иммуногенная готовность организма» определяются их наличием. Показана роль нормальных антител в бактерицидности крови, в опсонизации при фагоцитозе. Работами многих исследователей было показано, что нормальные антитела в основном являются макроглобулина-ми - IgM. Некоторые исследователи находили нормальные антитела в IgA- и IgG-классах иммуноглобулинов. В их составе могут быть как неполные, так и полные антитела (нормальные антитела к эритроцитам - см. Группы крови).

Синтез антител

Синтез антител протекает в две фазы. Первая фаза индуктивная, латентная (1-4 дня), при которой антитела и антителообразующие клетки не обнаруживаются; вторая фаза - продуктивная (начинается после индуктивной фазы), антитела обнаруживаются в плазматических клетках и оттекающей от лимфоидных органов жидкости. После первой фазы антителообразования начинается очень быстрый темп нарастания антител, нередко их содержание может удваиваться каждые 8 часов и даже быстрее. Максимальная концентрация различных антител в сыворотке крови после однократной иммунизации регистрируется на 5, 7,10 или 15-й день; после инъекции депонированных антигенов - на 21- 30-й или 45-й день. Далее через 1-3 или более месяцев титры антител резко падают. Однако иногда низкий уровень антител после иммунизации регистрируется в крови в течение ряда лет. Установлено, что первичная иммунизация большим числом различных антигенов сопровождается появлением вначале тяжелых IgM (19S)-антител, затем в течение короткого срока - IgM и IgG(7S)-антител и, наконец, одних легких 7S-антител. Повторная стимуляция сенсибилизированного организма антигеном вызывает ускорение образования обоих классов антител, укорочение латентной фазы антителообразования, срока синтеза 19S-антител и способствует преимущественному синтезу 7S-антител. Нередко 19S-антитела вовсе не появляются.

Выраженные различия между индуктивной и продуктивной фазой антителообразования обнаруживаются при исследовании их чувствительности к ряду воздействий, что имеет принципиальное значение для понимания природы специфической профилактики. Например, известно, что облучение до иммунизации задерживает или полностью угнетает антителообразование. Облучение в репродуктивную фазу антителообразования не влияет на содержание антител в крови.

Выделение и очистка антител

В целях усовершенствования метода выделения и очистки антител были предложены иммуносорбенты. В основе метода лежит перевод растворимых антигенов в нерастворимые путем присоединения их посредством ковалентных связей к нерастворимой основе из целлюлозы, сефадекса или другого полимера. Метод позволяет получить в высокой степени очищенные антитела в больших количествах. Процесс выделения антител с помощью иммуносорбентов включает три этапа:

1) извлечение антител из иммунной сыворотки;

2) отмывание иммуносорбента от неспецифических белков;

3) отщепление антител от отмытого иммуносорбента (обычно буферными растворами с низкими значениями pH). Кроме этого метода, известны и другие методы очистки антител. Их можно разделить на две группы: специфические и неспецифические. В основе первых лежит диссоциация антител из комплекса нерастворимый антиген - антитело (преципитат, агглютинат). Она осуществляется различными веществами; широко распространен метод ферментативного переваривания антигена или флоккулята токсин - антитоксин амилазой, трипсином, пепсином. Используется также тепловая элюция при t° 37-56°.

Неспецифические методы очистки антител основаны на выделении гамма-глобулинов: электрофорез в геле, хроматография на ионообменных смолах, фракционирование гель-фильтрацией через сефадексы. Широко известен метод осаждения сернокислым натрием или аммонием. Эти методы применимы в случаях высокой концентрации антител в сыворотке, например, при гипериммунизации.

Гельфильтрация через сефадексы, а также использование ионообменных смол позволяют разделить антитела по величине их молекул.

Применение антител

Антитела, особенно гамма-глобулины, применяются для терапии и профилактики дифтерии, кори, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, лептоспирозов, против стафилококков, возбудителей бешенства, гриппа и др. Специально приготовленные и очищенные диагностические сыворотки применяются в серологической идентификации возбудителей инфекций (см. Идентификация микробов). Было установлено, что пневмококки, стафилококки, сальмонеллы, бактериофаги и др., адсорбируя соответствующие антитела, прилипают к тромбоцитам, эритроцитам и другим чужеродным частицам. Этот феномен назван иммунным прилипанием. Было показано, что в механизме этого феномена играют роль белковые рецепторы тромбоцитов и эритроцитов, которые разрушаются трипсином, папаином и формалином. Реакция иммунного прилипания зависит от температуры. Ее учитывают по прилипанию корпускулярного антигена или по гемагглютинации, обусловленной растворимым антигеном в присутствии антител и комплемента. Реакция высокочувствительна и может быть использована как для определения комплемента, так и очень небольших (0,005-0,01 мкг азота) количеств антител. Иммунное прилипание усиливает фагоцитоз лейкоцитами.

Современные теории образования антител

Различают инструктивные теории антителообразования, согласно к-рым антиген прямо или косвенно участвует в формировании специфических иммуноглобулинов, и теории, предполагающие образование генетически предсуществующих антител ко всем возможным антигенам или клеток, синтезирующих эти антитела. К ним относятся селекционные теории и теория репрессии - дерепрессии, допускающая возможность синтеза одной клеткой любых антител. Предложены также теории, стремящиеся осмыслить процессы иммунологического ответа на уровне целостного организма с учетом взаимодействия различных клеток и общепринятых представлений о синтезе белка в организме.

Теория прямой матрицы Гауровитца-Полинга сводится к тому, что антиген, поступив внутрь клеток, вырабатывающих антитела, играет роль матрицы, оказывающей влияние на образование молекулы иммуноглобулина из пептидных цепей, синтез которых протекает без участия антигена. «Вмешательство» антигена наступает лишь во второй фазе формирования белковой молекулы - фазе скручивания пептидных цепей. Антиген так изменяет концевые N-аминокислоты будущего антитела (иммуноглобулина или его отдельных пептидных цепей), что они становятся комплементарными к детерминантам антигена и легко вступают с ним в связь. Образовавшееся таким образом антитела отщепляется от антигена, поступает в кровь, а освободившийся антиген принимает участие в формировании новых молекул антител. Эта теория вызвала ряд серьезных возражений. Она не может объяснить образования иммунологической толерантности; превосходящего количества вырабатываемых клеткой антител в единицу времени на имеющееся в ней во много раз меньшее число молекул антигена; продолжительности выработки антител организмом, исчисляемой годами или всей жизнью, по сравнению со значительно меньшим сроком сохранения антигена в клетках и т. д. Следует также учесть, что клетки плазматического или лимфоидного ряда, вырабатывающие антитела, не ассимилируют антиген, хотя присутствие нативного антигена или его фрагментов в антителосинтезирующих клетках полностью исключить нельзя. В последнее время Гауровитцем (F. Haurowitz, 1965) предложена новая концепция, по которой антиген изменяет не только вторичную, но и первичную структуру иммуноглобулина.

Теория непрямой матрицы Бернета - Феннера получила известность в 1949 году. Ее авторы считали, что макромолекулы антигена и скорее всего его детерминанты проникают в ядра клеток зародышевого типа и вызывают наследственно закрепленные изменения в них, следствием которых является образование антител к данному антигену. Допускается аналогия между описываемым процессом и трансдукцией у бактерий. Приобретенное клетками новое качество образования иммунных глобулинов передается потомству клеток в бесчисленных поколениях. Однако вопрос о роли антигена в описываемом процессе оказался спорным.

Именно это обстоятельство явилось причиной возникновения теории естественной селекции Ерне (K. Jerne, 1955).

Теория естественной селекции Ерне. Согласно этой теории антиген не является матрицей для синтеза антител и не вызывает генетических изменений в клетках-продуцентах антител. Его роль сводится к селекции имеющихся «нормальных» антител, спонтанно возникающих к различным антигенам. Происходит это будто бы так: антиген, попав в организм, находит соответствующее антитело, соединяется с ним; образовавшийся комплекс антиген - антитело поглощается клетками, вырабатывающими антитела, и последние получают стимул производить антитела именно такого рода.

Клонально-селекционная теория Бернета (F. Burnet) явилась дальнейшим развитием идеи Ерне о селекции, но не антител, а клеток, производящих антитела. Бернет полагает, что в результате общего процесса дифференциации в эмбриональном и постнатальном периодах из мезенхимальных клеток образуется множество клонов лимфоидных или иммунологически компетентных клеток, способных реагировать с различными антигенами или их детерминантами и вырабатывать антитела - иммуноглобулины. Характер реагирования лимфоидных клеток на антиген в эмбриональном и постнатальном периодах различен. Зародыш либо совсем не вырабатывает глобулинов, либо синтезирует их немного. Однако допускается, что те его клоны клеток, которые способны вступить в реакцию с антигенными детерминантами собственных белков, реагируют с ними и в результате этой реакции уничтожаются. Так, вероятно, погибают клетки, образующие анти-А-агглютинины у лиц с группой крови А и анти-В-агглютинины - у лиц с группой крови В. Если эмбриону ввести какой-либо антиген, то аналогичным образом он уничтожит соответствующий клон клеток, и новорожденный в течение всей последующей жизни теоретически будет толерантным к данному антигену. Процесс уничтожения всех клонов клеток к собственным белкам зародыша заканчивается к моменту его рождения или выхода из яйца. Теперь у новорожденного осталось только «свое», и любое «чужое», попавшее в его организм, он распознает. Бернет допускает также сохранение «запретных» клонов клеток, способных реагировать с аутоантигенами органов, которые в процессе развития были изолированы от клеток, вырабатывающих антитела. Распознавание «чужого» обеспечивается оставшимися клонами мезенхимальных клеток, на поверхности которых имеются соответствующие антидетерминанты (рецепторы, клеточные антитела), комплементарные к детерминантам «чужого» антигена. Природа рецепторов детерминирована генетически, то есть закодирована в хромосомах и не привносится в клетку вместе с антигеном. Наличие готовых рецепторов неизбежно ведет к реакции данного клона клеток с данным антигеном, следствием которой теперь являются два процесса: образование специфических антител - иммуноглобулинов и размножение клеток данного клона. Бернет допускает, что мезенхимальная клетка, получившая антигенное раздражение, в порядке митоза дает начало популяции дочерних клеток. Если такая клетка осела в мозговом веществе лимфатического узла, она дает начало образованию плазматических клеток, при оседании в лимфатических фолликулах - лимфоцитам, в костном мозге - эозинофилам. Дочерние клетки склонны к соматическим необратимым мутациям. При расчете на весь организм число мутирующих клеток за сутки может составить 100 ООО или 10 млн., и, следовательно, мутации обеспечат клоны клеток к любому антигену. Теория Бернета вызвала огромный интерес исследователей и большое число проверочных экспериментов. Важнейшими подтверждениями теории явились доказательства присутствия на предшественниках антителопродуцирующих клеток (лимфоцитах костномозгового происхождения) антителоподобных рецепторов иммуноглобулиновой природы и наличия в антителопродуцирующих клетках механизма интерцистронного исключения в отношении антител различной специфичности.

Теория репрессии и дерепрессии сформулирована Силардом (L. Szilard) в 1960 году. Согласно этой теории каждая клетка, вырабатывающая антитело, потенциально может синтезировать любое антитело к любому антигену, но этот процесс у нее заторможен репрессором фермента, участвующего в синтезе иммуноглобулина. В свою очередь образование репрессора может затормозиться влиянием антигена. Силард считает, что образование антител контролируется особыми неудваивающимися генами. Число их достигает 10 000 на каждый одинарный (гаплоидный) набор хромосом.

Ледерберг (J. Lederberg) считает, что в генах, ответственных за синтез глобулинов, имеются участки, контролирующие образование активных центров антител. В норме функция названных участков заторможена, и поэтому идет синтез нормальных глобулинов. Под влиянием антигена, а также, возможно, под действием некоторых гормонов происходит растормаживание и стимулирование деятельности участков гена, ответственных за образование активных центров антител, и клетка начинает синтезировать иммунные глобулины.

По мнению H. Н. Жукова-Вережникова (1972), эволюционными предшественниками антител были защитные ферменты, аналогичные появляющимся у бактерий с приобретенной антибиотикорезистентностью. Как и антитела, ферменты состоят из активной (по отношению к субстрату) и пассивной частей молекулы. В силу экономичности механизм «один фермент - один субстрат» сменился механизмом «единых молекул с варьирующей частью», то есть антител с вариабельными активными центрами. Информация об антителообразовании реализуется в зоне «резервных генов», или в «зоне избыточности» на ДНК. Такая избыточность, видимо, может локализоваться в ядерной или плазмидной ДНК, которая хранит «эволюционную информацию..., игравшую роль внутреннего механизма, „начерно“ контролирующего наследственную изменчивость». Эта гипотеза содержит инструктивный компонент, но не является полностью инструктивной.

П. Ф. Здродовский отводит антигену роль дерепрессора определенных генов, контролирующих синтез комплементарных антител. Одновременно антиген, как допускает Здродовский в соответствии с теорией Селье, раздражает аденогипофиз, в результате чего происходит выработка соматотропное (СТГ) и адренокортикотропного (АКТГ) гормонов. СТГ стимулирует плазмоцитарную и антителообразующую реакцию лимфоидных органов, в свою очередь стимулированных антигеном, а АКТГ, воздействуя на кору надпочечников, вызывает выделение ею кортизона. Этот последний в иммунном организме угнетает плазмоцитарную реакцию лимфоидных органов и синтез клетками антител. Все эти положения были подтверждены экспериментально.

Действие системы гипофиз - надпочечники на продукцию антител может выявляться лишь в предварительно иммунизированном организме. Именно эта система организует анамнестические серологические реакции в ответ на введение в организм различных неспецифических раздражителей.

Углубленное изучение клеточных изменений в процессе иммунологического ответа и накопление большого количества новых фактов обосновали положение, согласно которому иммунологический ответ осуществляется лишь в результате кооперированного взаимодействия определенных клеток. В соответствии с этим предложено несколько гипотез.

1. Теория кооперации двух клеток. Накоплено много фактов, свидетельствующих о том, что иммунологический ответ в организме осуществляется в условиях взаимодействия различных типов клеток. Имеются подтверждения того, что макрофаги первыми ассимилируют и модифицируют антиген, но в последующем «инструктируют» лимфоидные клетки о синтезе антител. Одновременно показано, что происходит кооперация и между лимфоцитами, относящимися к различным субпопуляциям: между Т-лимфоцитами (тимусзависимые, антнгенреактивные, происходящие из вилочковой железы) и В-клетками (тимуснезависимые, предшественники антителообразующих клеток, костномозговые лимфоциты).

2. Теории кооперации трех клеток. Согласно взглядам Ройтта (I. Roitt) и др. (1969) антиген захватывается и перерабатывается макрофагами. Такой антиген стимулирует антигенреактивные лимфоциты, подвергающиеся трансформации в бластоидные клетки, обеспечивающие гиперчувствительность замедленного типа и превращающиеся в долгоживущие клетки иммунологической памяти. Эти клетки вступают в кооперацию с антителообразующими клетками-предшественниками, которые в свою очередь дифференцируются, пролиферируя в антителопродуцирующие клетки. По мнению Рихтера (М. Richter, 1969), большинство антигенов обладает слабым сродством для антителообразующих клеток, поэтому для выработки антител необходимо следующее взаимодействие процессов: антиген+макрофаг - переработанный антиген+антигенреактивная клетка - активированный антиген+предшественник антителообразующей клетки - антитела. В случае высокого сродства антигена процесс будет выглядеть так: антиген+предшественник антителообразующих клеток - антитела. Предполагается, что в условиях повторного стимулирования антигеном последний непосредственно вступает в контакт с антителообразующей клеткой или клеткой иммунологической памяти. Это положение подтверждается большей радиорезистентностью повторного иммунологического ответа, чем первичного, что объясняется различной устойчивостью клеток, участвующих в иммунологическом ответе. Постулируя необходимость трехклеточного кооперирования в антителогенезе, Р. В. Петров (1969, 1970) считает, что синтез антител произойдет лишь в том случае, если стволовая клетка (предшественник антителообразующей клетки) одновременно получит из макрофага переработанный антиген, а из антигенреактивной клетки индуктор иммунопоэза, образуемый после ее (антигенреактивной клетки) стимуляции антигеном. Если происходит контакт стволовой клетки только с переработанным макрофагом антигеном, то создается иммунологическая толерантность (см. Толерантность иммунологическая). Если же налицо контакт стволовой клетки только с антигенреактивной клеткой, то происходит синтез неспецифического иммуноглобулина. Предполагается, что эти механизмы лежат в основе инактивации несингенных стволовых клеток лимфоцитами, так как индуктор иммунопоэза, попадая в аллогенную стволовую клетку, является для нее антиметаболитом (сингенные - клетки с идентичным геномом, аллогенные - клетки того же вида, по с иным генетическим составом).

Аллергические антитела

Аллергические антитела - специфические иммуноглобулины, образующиеся под действием аллергенов у человека и животных. При этом имеются в виду циркулирующие в крови антитела при аллергических реакциях немедленного типа. Различают три основных вида аллергических антител: кожно-сенсибилизирующие, или реагины; блокирующие и гемагглютинирующие. Биологические, химические и физико-химические свойства аллергических антител человека своеобразны (табл .).

Эти свойства резко отличаются от свойств преципитирующих, комплементсвязывающих антител, агглютининов и других, описываемых в иммунологии.

Реагинами принято обозначать гомологические кожно-сенсибилизирующие антитела человека. Это важнейший вид аллергических антител человека, основным свойством которых является способность осуществлять реакцию пассивного переноса повышенной чувствительности на кожу здорового реципиента (см. Прауснитца-Кюстнера реакция). Реагины обладают целым рядом характерных свойств, отличающих их от сравнительно хорошо изученных иммунных антител. Многие вопросы, касающиеся свойств реагинов и их иммунологической природы, остаются, однако, нерешенными. В частности, нерешенным является вопрос о гомогенности или гетерогенности реагинов в смысле их принадлежности к определенному классу иммуноглобулинов.

Блокирующие антитела возникают у больных поллинозами в процессе специфической гипосенсибилизирующей терапии к тому антигену, которым производится гипосенсибилизация. Свойства этого вида антител напоминают свойства преципитирующих антител.

Под гемагглютинирующими антителами обычно подразумевают антитела сыворотки крови человека и животных, способные специфически агглютинировать эритроциты, соединенные с пыльцевым аллергеном (реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации). Связывание поверхности эритроцита с аллергеном пыльцы достигается разнообразными методами, напр, с помощью танина, формалина, дважды диазотированного бензидина. Гемагглютинирующие антитела удается обнаружить у людей, имеющих повышенную чувствительность к пыльце растений, как до, так и после специфической гипосенсибилизирующей терапии. В процессе этой терапии происходит трансформация отрицательных реакций в положительные или повышение титров реакции гемагглютинации. Гемагглютинирующие антитела обладают свойством довольно быстро адсорбироваться на эритроцитах, обработанных пыльцевым аллергеном, особенно некоторыми его фракциями. Иммуносорбенты удаляют гемагглютинирующие антитела быстрее, чем реагины. Гемагглютинирующая активность связана в некоторой степени и с кожно-сенсибилизирующими антителами, однако роль кожно-сенсибилизирующих антител в гемагглютинации, по-видимому, невелика, так как не существует никакой корреляции между кожно-сенсибилизирующими и гемагглютинирующими антителами. С другой стороны, существует корреляция между гемагглютинирующими и блокирующими антителами как у лиц с аллергией к пыльце растений, так и у здоровых лиц, иммунизированных растительной пыльцой. Эти два вида антител обладают многими сходными свойствами. В процессе специфической гипосенсибилизирующей терапии происходит повышение уровня как того, так и другого вида антител. Гемагглютинирующие антитела к пенициллину не идентичны кожно-сенсибилизирующим антителам. Основной причиной образования гемагглютинирующих антител явилась пенициллинотерапия. По-видимому, гемагглютинирующие антитела следует отнести к группе антител, именуемых рядом авторов «антитела ми-свидетелями».

В 1962 году Шелли (W. Shelley) предложил специальный диагностический тест, основанный на так называемые дегрануляции базофильных лейкоцитов крови кролика под действием реакции аллергена со специфическим антителами. Однако характер антител, которые принимают участие в данной реакции, и связь их с циркулирующими реагинами недостаточно выяснены, хотя имеются данные о корреляции этого вида антител с уровнем реагинов у больных поллинозом.

Установление оптимальных соотношений аллергена и исследуемой сыворотки является чрезвычайно важным в практическом отношении, особенно при исследованиях с видами аллергенов, сведения о которых еще не содержатся в соответствующей литературе.

К аллергическим антителам животных можно отнести следующие виды антител: 1) антитела при экспериментальной анафилаксии; 2) антитела при спонтанных аллергических заболеваниях животных; 3) антитела, играющие роль при развитии реакции Артюса (типа преципитирующих). При экспериментальной анафилаксии, как общей, так и местной, в крови животных обнаруживают специальные виды анафилактических антител, обладающих свойством пассивно сенсибилизировать кожу животных того же вида.

Было показано, что анафилактическая сенсибилизация морских свинок аллергенами пыльцы тимофеевки луговой сопровождается циркуляцией в крови кожно-сенсибилизирующих антител Эти кожно-сенсибилизирующие тела обладают свойством осуществлять гомологическую пассивную сенсибилизацию кожи in vivo. Наряду с этими гомологическими кожно-сенсибилизирующими антителами при общей сенсибилизации морских свинок аллергенами пыльцы тимофеевки луговой в крови циркулируют антитела, выявляемые реакцией пассивной гемагглютинации с бис-диазотированным бензидином. Кожно-сенсибилизирующие антитела, осуществляющие гомологичный пассивный перенос и имеющие положительную корреляцию с показателем анафилаксии, относят к группе гомологических анафилактических антител, или гомоцитотропных антител. Употребляя термин «анафилактические антитела», авторы приписывают им ведущую роль в реакции анафилаксии. Стали появляться исследования, подтверждающие существование гомоцитотропных антител к белковым антигенам и конъюгатам у различных видов экспериментальных животных. Ряд авторов выделяет три вида антител, участвующих в аллергических реакциях немедленного типа. Это антитела, связанные с новым типом иммуноглобулинов (IgE) у человека и аналогичные антитела у обезьян, собак, кроликов, крыс, мышей. Второй вид антител - антитела типа морской свинки, способные фиксироваться на тучных клетках и изологичных тканях. Они отличаются рядом свойств, в частности, они более термостабильны. Считают, что антитела типа IgG могут быть и у человека вторым видом анафилактических антител. Третий вид - антител, сенсибилизирующие гетерологичные ткани, принадлежащие, например, у морских свинок к классу γ 2 . У человека только антитела типа IgG обладают способностью сенсибилизировать кожу морской свинки.

При заболеваниях животных описаны аллергические антитела, образующиеся при спонтанных аллергических реакциях. Эти антитела термолабильны, обладают кожно-сенсибилизирующими свойствами.

Неполные антитела в судебно-медицинском отношении применяются при определении антигенов ряда изосерологических систем (см. Группы крови) для установления принадлежности крови определенному лицу в случаях уголовных преступлений (убийства, половые преступления, транспортные происшествия, нанесение телесных повреждений и др.), а также при экспертизе спорного отцовства и материнства. В отличие от полных антител, они не вызывают агглютинации эритроцитов в солевой среде. Среди них различают антитела двух видов. Первый из них - агглютиноиды. Эти антитела способны вызвать склеивание эритроцитов в белковой или макромолекулярной среде. Второй вид антител - криптагглютиноиды, которые реагируют в непрямой пробе Кумбса с антигаммаглобулиновой сывороткой.

Для работы с неполными антителами предложен ряд методов, подразделяющихся на три основные группы.

1. Методы конглютинации. Отмечено, что неполные антитела способны вызывать агглютинацию эритроцитов в белковой или макромолекулярной среде. В качестве таких сред используют сыворотку крови группы AB (не содержащую антител), бычий альбумин, декстран, биогель - особо очищенную желатину, приведенную буферным раствором к нейтральному pH, и др. (см. Конглютинация).

2. Ферментные методы. Неполные антитела способны вызвать агглютинацию эритроцитов, предварительно подвергнутых обработке некоторыми ферментами. Для такой обработки применяют трипсин, фицин, папаин, экстракты из хлебных дрожжей, протелин, бромелин и др.

3. Проба Кумбса с антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция).

Неполные антитела, относящиеся к агглютиноидам, могут проявить свое действие во всех трех группах методов. Антитела, относящиеся к криптагглютиноидам, не способны агглютинировать эритроциты не только в солевом растворе, но и в макромолекулярной среде, а также блокировать их в последней. Эти антитела открываются только в непрямой пробе Кумбса, с помощью которой открываются не только антитела, относящиеся к криптагглютиноидам, но и антитела, являющиеся агглютиноидами.

Моноклональные антитела

Из дополнительных материалов, том 29

Классический способ производства антител для диагностических и исследовательских целей заключается в иммунизации животных определенными антигенами и последующем получении иммунных сывороток, содержащих антитела необходимой специфичности. Этот метод имеет ряд недостатков, связанных прежде всего с тем, что иммунные сыворотки включают разнородные и гетерогенные популяции антител, различающихся по активности, аффинности (сродству к антигену) и биологическому действию. Обычные иммунные сыворотки содержат смесь антител, специфичных как в отношении заданного антигена, так и в отношении контаминирую-щих его белковых молекул. Новый тип иммунологических реагентов представляют собой моноклональные антитела, получаемые с помощью клонов гибридных клеток - гибридом (см.). Несомненным преимуществом моноклональных антител является их генетически предопределенная стандартность, неограниченная воспроизводимость, высокая чувствительность и специфичность. Первые гибридомы были выделены в начале 70-х годов 20 века, однако реальное освоение эффективной технологии создания моноклональных антител связано с исследованиями Келера и Милыптейна (G. Kohler, С. Milstein), результаты которых были опубликованы в 1975- 1976 годы. В последующее десятилетие новое направление клеточной инженерии, связанное с получением моноклональных антител, получило дальнейшее развитие.

Гибридомы образуются при слиянии лимфоцитов гипериммунизированных животных с клетками перевиваемых плазмоцитом различного происхождения. Гибридомы наследуют от одного из родителей способность продуцировать специфические иммуноглобулины, а от второго - свойство неограниченно размножаться. Клонированные популяции гибридных клеток могут длительное время продуцировать генетически однородные иммуноглобулины заданной специфичности - моноклональные антитела. Наиболее широко применяются моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, полученными с использованием уникальной мышиной клеточной линии МОРС 21 (РЗ).

К труднопреодолимым проблемам технологии моноклональных антител относятся сложность и трудоемкость получения устойчивых высокопродуктивных гибридных клонов, вырабатывающих моноспецифические иммуноглобулины; сложность получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к слабым антигенам, неспособным индуцировать образование стимулированных В-лимфоцитов в достаточном количестве; отсутствие у моноклональных антител некоторых свойств иммунных сывороток, напр, свойства образовывать преципитаты с комплексами других антител и антигенов, на котором основаны многие диагностические тест-системы; низкая частота слияния лимфоцитов, продуцирующих антитела, с миеломными клетками и ограниченная стабильность гибридом в массовых культурах; низкая стабильность в процессе хранения и повышенная чувствительность препаратов моноклональных антител к изменениям pH, температуры инкубации, а также к замораживанию, оттаиванию и воздействию химических факторов; сложность получения гибридом или перевиваемых продуцентов человеческих моноклональных антител.

Практически все клетки в популяции клонированных гибридом продуцируют моноклональные антитела одного и того же класса и подкласса иммуноглобулинов. Моноклональные антитела можно модифицировать с помощью методов клеточной иммунной инженерии. Так, можно получать «триомы» и «квадромы», продуцирующие моноклональные антитела двойной заданной специфичности, изменять продукцию пента-мерных цитотоксических IgM на продукцию пентамерных нецитотоксических IgM, мономерных нецитотоксических IgM или IgM с уменьшенной аффинностью, а также переключать (с сохранением антигенной специфичности) секрецию IgM на секрецию IgD, а секрецию IgGl - на секрецию IgG2a, IgG2b или IgA.

Мышиный геном обеспечивает синтез свыше 1*10 7 различных вариантов антител, специфически взаимодействующих с эпитопами (антигенными детерминантами) белковых, углеводных или липидных антигенов, присутствующих в клетках или микроорганизмах. Возможно образование тысяч различных антител к одному антигену, отличающихся по специфичности и аффинности; например, в результате иммунизации однородными человеческими клетками индуцируется до 50 000 различных антител. Использование гибридом позволяет отбирать практически все варианты моноклональных антител, которые могут быть индуцированы к данному антигену в организме экспериментального животного.

Многообразие моноклональных антител, получаемых к одному и тому же белку (антигену), обусловливает необходимость определения их более тонкой специфичности. Характеристика и отбор иммуноглобулинов с требуемыми свойствами среди многочисленных видов моноклональных антител, взаимодействующих с исследуемым антигеном, превращаются зачастую в более трудоемкую экспериментальную работу, чем получение моноклональных антител. Эти исследования включают разделение набора антител на группы, специфичные к тем или иным эпитопам, с последующим отбором в каждой группе оптимального варианта по аффинности, стабильности и другим параметрам. Для определения эпитопной специфичности наиболее часто используют метод конкурентного иммуноферментного анализа.

Рассчитано, что первичная последовательность из 4 аминокислот (обычный размер эпитопа) может встречаться до 15 раз в последовательности аминокислот белковой молекулы. Однако перекрестные реакции с моноклональными антителами наблюдаются с гораздо меньшей частотой, чем можно было бы ожидать, исходя из этих расчетов. Происходит это потому, что далеко не все указанные участки экспрессируются на поверхности белковой молекулы и узнаются антителами. Кроме того, моноклональные антитела обнаруживают последовательности аминокислот только в определенной конформации. Следует учитывать и то обстоятельство, что последовательность аминокислот в белковой молекуле не распределяется среднестатистически, а участки связывания антител бывают значительно крупнее, чем минимальный эпитоп, содержащий 4 аминокислоты.

Использование моноклональных антител открыло недоступные ранее возможности для изучения механизмов функциональной активности иммуноглобулинов. Впервые с помощью моноклональных антител удалось выявить антигенные различия у белков, ранее серологически неразличимых. Были установлены новые субтиповые и штаммовые различия между вирусами и бактериями, открыты новые клеточные антигены. С помощью моноклональных антител обнаружены антигенные связи между структурами, существование которых невозможно было достоверно доказать с использованием поликлональных (обычных иммунных) сывороток. Применение моноклональных антител позволило идентифицировать консервативные антигенные детерминанты вирусов и бактерий, обладающие широкой групповой специфичностью, а также штаммоспецифические эпитопы, отличающиеся большой вариабельностью и изменчивостью.

Принципиальное значение имеет обнаружение с помощью моноклональных антител антигенных детерминант, индуцирующих выработку защитных и нейтрализующих антител к возбудителям инфекционных болезней, что важно для создания лечебно-профилактических препаратов. Взаимодействие моноклональных антител с соответствующими эпитопами может приводить к возникновению стерических (пространственных) препятствий для проявления функциональной активности белковых молекул, а также к аллостерическим изменениям, которые преобразуют конформацию активного участка молекулы и блокируют биологическую активность белка.

Только с помощью моноклональных антител удалось исследовать механизмы кооперативного действия иммуноглобулинов, взаимного потенцирования или взаимного ингибирования антител, направленных к различным эпитопам одного и того же белка.

Для производства массовых количеств моноклональных антител чаще используют асцитные опухоли мышей. Более чистые препараты моноклональных антител могут быть получены на бессывороточных средах в ферментируемых суспензионных культурах или в диализных системах, в микроинкапсулированных культурах и устройствах типа капиллярных культур. Для получения 1 г моноклональных антител требуется примерно 0,5 л асцитной жидкости или 30 л культуральной жидкости, инкубированной в ферментерах со специфическими гибридомными клетками. В производственных условиях вырабатывают очень большие количества моноклональных антител. Значительные затраты на производство моноклональных антител оправдываются высокой эффективностью очистки белков на иммобилизованных моноклональных антителах, причем коэффициент очистки белка в одноступенчатой процедуре аффинной хроматографии достигает нескольких тысяч. Аффинная хроматография на основе моноклональных антител применяется при очистке гормона роста, инсулина, интерферонов, интерлейкинов, продуцируемых измененными с помощью методов генетической инженерии штаммами бактерий, дрожжей или эукариотических клеток.

Быстро развивается использование моноклональных антител в составе диагностических наборов. К 1984 году в США было рекомендовано для клинических исследований около 60 диагностических тест-систем, приготовленных с применением моноклональных антител. Основное место среди них занимают тест-системы для ранней диагностики беременности, определения содержания в крови гормонов, витаминов, лекарственных препаратов, лабораторной дртгностики инфекционных болезней.

Сформулированы критерии отбора моноклональных антител для их использования в качестве диагностических реагентов. К ним относятся высокая аффинность к антигену, обеспечивающая связывание при низкой концентрации антигена, а также эффективная конкуренция с антителами организма хозяина, уже связавшимися с антигенами в исследуемом образце; направленность против антигенного участка, обычно не распознаваемого антителами организма хозяина и потому не маскированного этими антителами; направленность против повторяющихся антигенных детерминант поверхностных структур диагностируемого антигена; поливалентность, обеспечивающая более высокую активность IgM по сравнению с IgG.

Моноклональные антитела можно использовать в качестве диагностических препаратов для определения гормонов и лекарственных препаратов, токсических соединений, маркеров злокачественных опухолей, для классификации и подсчета лейкоцитов, более точного и быстрого определения групповой принадлежности крови, для выявления антигенов вирусов, бактерий, простейших, для диагностики аутоиммунных заболеваний, обнаружения аутоантител, ревматоидных факторов, определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Моноклональные антитела позволяют успешно дифференцировать поверхностные структуры лимфоцитов и с большой точностью идентифицировать основные субпоиуля-ции лимфоцитов, классифицировать на семейства клетки лейкозов и лимфом человека. Новые реагенты на основе моноклональных антител облегчают процедуру определения В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, подклассов Т-лимфоцитов, превращая ее в один из простых этапов подсчета формулы крови. С помощью моноклональных антител можно избирательно удалять ту или иную субпопуляцию лимфоцитов, выключая соответствующую функцию системы клеточного иммунитета.

Обычно диагностические препараты на базе моноклональных антител содержат иммуноглобулины, меченные радиоактивным йодом, пероксидазой или другим ферментом, применяемым в иммуноферментных реакциях, а также флюорохромами, например флюоресцеинизотиоцианатом, используемыми в иммунофлюоресцентном методе. Высокая специфичность моноклональных антител представляет особую ценность при создании усовершенствованных диагностических препаратов, повышении чувствительности и специфичности радиоиммуно логических, иммуноферментных, иммунофлюорес-центных методов серологического анализа, типировании антигенов.

Терапевтическое применение моноклональных антител может оказаться эффективным при необходимости нейтрализации токсинов различного происхождения, а также антигеноактивных ядов, для достижения иммунодепрессии при трансплантации органов, для индукции зависимого от комплемента цитолиза опухолевых клеток, для коррекции состава Т-лимфоцитов и иммунорегуляции, для нейтрализации бактерий, устойчивых к антибиотикам, пассивной иммунизации против патогенных вирусов.

Основным препятствием на пути терапевтического использования моноклональных антител является возможность развития побочных иммунологических реакций, связанных с гетерологичным происхождением моноклональных иммуноглобулинов. Для преодоления этого необходимо получение человеческих моноклональных антител. Успешные исследования в этом направлении позволяют применять моноклональные антитела в качестве векторов для целенаправленной доставки ковалентно связанных лекарственных препаратов.

Разрабатываются терапевтические препараты, специфичные к строго определенным клеткам и тканям и обладающие направленной цитотоксичностью. Это достигается конъюги-рованием высокотоксичных белков, напр, дифтерийного токсина, с моноклональными антителами, узнающими клетки-мишени. Направляемые моноклональными антителами, химиотерапевтические агенты способны избирательно уничтожать в организме опухолевые клетки, несущие специфический антиген. Моноклональные антитела могут выполнять роль вектора и при встраивании в поверхностные структуры липосом, что обеспечивает доставку к органам или клеткам-мишеням значительных количеств лекарственных препаратов, заключенных в липосомах.

Последовательное применение моноклональных антител не только повысит информативность обычных серологических реакций, но и подготовит появление принципиально новых подходов к исследованию взаимодействия антигенов и антител.

Библиография

Бернет Ф. Клеточная иммунология, пер. с англ., М., 1971; Гаурови ц Ф. Иммунохимия и биосинтез антител, пер. с англ., М., 1969, библиогр.; Доссе Ж. Иммуногематология, пер. с франц., М., 1959; Здродовский П. Ф. Проблемы инфекции, иммунитета и аллергии, М., 1969, библиогр.; Иммунохи-мический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, с. 21, М., 1968; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., М., 1968, библиогр.; Незлин Р. С. Строение биосинтеза антител. М., 1972, библиогр.; Носсе л Г. Антитела и иммунитет, пер. с англ., М., 1973, библиогр.; Петров Р. В. Формы взаимодействия генетически различающихся клеток лимфоидных тканей (трехклеточная система иммуногенеза), Усп. совр. биол., т. 69, в. 2, с. 261, 1970; Утешев Б. С. и Бабичев В. А. Ингибиторы биосинтеза антител. М., 1974; Эфроимсон В. П. Иммуногенетика, М., 1971, библиогр.

Аллергические А. - Адо А. Д. Аллергия, Многотомн. руководство по пат. физиол., под ред. H. Н. Сиротинина, т. 1, с. 374, М., 1966, библиогр.; Адо А. Д. Общая аллергология, с. 127, М., 1970; Польнер А. А., Вермонт И. Е. иСерова Т. И. К вопросу об иммунологической природе реагинов при поллинозах, в кн.: Пробл. аллергол., под ред. А. Д. Адо и А. А. Подколзина, с. 157, М., 1971; Bloch К. J. The anaphylactic antibodies of mammals including man, Progr. Allergy, v. 10, p. 84, 1967, bibliogr.; Ishizaka K. a. Ishizaka T. The significance of immunoglobulin E in reaginic hypersensitivity, Ann. Allergy, v. 28, p. 189, 1970, bibliogr.; Lichtenstein L. М., Levy D. A. a. Ishizaka K. In vitro reversed anaphylaxis, characteristics of anti-IgE mediated histamine release, Immunology, v. 19, p. 831, 1970; Sehon A. H. Heterogeneity of antibodies in allergic sera, в кн.: Molec. a. celL basis of antibody formation, ed. by J. Sterzl, p. 227, Prague, 1965, bibliogr.; Stanworth D. R. Immunochemical mechanisms of immediate-type hypersensitivity reactions, Clin. exp. Immunol., У. 6, p. 1, 1970, bibliogr.

Моноклональные антитела - Гибридомы: новый уровень биологического анализа, под ред. Р. Г. Кеннета и др., М., 1983; Рохлин О. В. Моноклональные антитела в биотехнологии и медицине, в кн.: Биотехнология, под ред. А. А. Баева, с. 288, М., 1984; N о w i n s k i R. C. a. o. Monoclonal antibodies for diagnosis of infectious diseases in humans, Science, v. 219, p. 637, 1983; Ollson L. Monoclonal antibodies in clinical immunobiology, Derivation, potential and limitations, Allergy, v. 38, p. 145, 1983; Sinko vies J. G. a. D r e e s m a n G. R. Monoclonal antibodies of hybridomas, Rev. infect. Dis., v. 5, p. 9, 1983.

М. В. Земсков, H. В. Журавлева, В. М. Земсков; А. А. Польнер (алл.); А. К. Туманов (суд.); А. С. Новохатский (Моноклональные антитела).

Антите­ла - это белки, а синтез каждого белка запрограммирован соответствующим геном.

Схе­матически полный ген L-цепи иммуноглобулинов: L (область, коди рующая лидерный пептид, необходимый для секреции иммуноглобулинов из клетки) - интрон - V-ген - интрон -J-ген - интрон - С-ген.

Схе­матически полный ген Н-цепи иммуноглобулинов: L-ген - интрон - V-ген - интрон - D-ген - интрон - J-ген - интрон - С-ген.

Точки объединения зародышевых генов строго не фиксированы. Это увеличива­ет количество возможных вариантов полипептидных цепей, а в том случае, когда они участвуют в формировании активных центров, то и их разнообразия. Кроме то­го, в период созревания В-лимфоцитов в V-генах происходят точечные соматичес­кие мутации, которые окончательно подгоняют структуру активного центра антите­ла к структуре детерминанта антигена. Считается, что общее количество вариантов антител возрастает за счет неточности сплайсинга и соматических мутаций еще в 100 раз и составляет около 2 млрд:

Таким образом, приобретенный иммунитет может быть обеспечен к любому воз­будителю, к любому возможному чужеродному антигену. Решающий вклад в обеспе­чение многообразия иммуноглобулинов (специфичности антител) вносят следую­щие механизмы:

1. наличие множества зародышевых генов иммуноглобулинов;

2. внутригенные рекомбинации, обусловленные экзон-интронной структурой V-, D-,J-, С-генов;

3. ассоциация различных L-цепей с различными Н-цепями;

4. неточность сплайсинга;

соматические мутации V-генов в зрелых В-лимфоцитах.

14. Центральные и периферические органы иммунитета. Основные формы иммунного ответа. Роль антител в формировании иммунитета. Полные и неполные антитела методы их обнаружения.

Центральные органы иммунитета. К ним относятся костный мозг, тимус (вилочковая железа), сумка Фабрициуса у птиц, печень у млекопитающих.

Периферические отделы иммунной системы. К ним относятся: селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани желудоч­но-кишечного тракта (пейеровы бляшки и солитарные фолликулы), а также кровь и лимфа, в которые поступают и непрерывно в них циркулируют все иммунокомпетентные клетки. В селезенке содержится больше всего плазматических клеток, воз­никающих в результате дифференцировки из В-лимфоцитов и являющихся основ­ными продуцентами антител.

Формы иммунного ответа: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция ги­перчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замед­ленного типа (в том числе трансплантационный иммунитет), иммунологическая то­лерантность, идиотип-антиидиотипические отношения.

Благодаря своей способности специфически взаимодействовать с бактериальны­ми клетками и продуктами их жизнедеятельности, в том числе с токсинами и фер­ментами, а также с другими микроорганизмами, антитела играют важную роль в формировании приобретенного постинфекционного, поствакцинального и пассив­ного иммунитета. Эта их роль заключается в том, что связываясь с токсинами, они нейтрализуют их действие и обеспечивают формирование антитоксического имму­нитета. Связываясь с вирусами, особенно блокируя рецепторы, с помощью которых они адсорбируются на клетках, антитела создают иммунитет против вирусов. Обра­зование комплекса антитело + антиген запускает классический путь активации си­стемы комплемента со всеми его эффекторными последствиями (лизис бактерий, опсонизация, формирование очага воспаления, стимуляция системы макрофагов). Антитела, взаимодействуя с бактериями, опсонизируют их, т. е. делают их фагоци­тоз более эффективным. В результате взаимодействия антител с растворимыми ан­тигенами, выделяющимися в кровь, образуются так называемые циркулирующие иммунные комплексы, с помощью которых антигены выводятся из организма, в ос­новном, желчью и мочой.

Cуще­ствует два типа антигенов - полноценные и неполноценные.

Полноценные антигены обладают обеими функциями антигена: способностью индуцировать образование антител и специфически с ними взаимодействовать.

Неполноценные антигены сами по себе способностью индуцировать образование антител не обладают, они приоб­ретают это свойство только после соединения с белками или другими полноценными антигенами. Такие неполноценные антигены называются гаптенами или полугаптенами.

Неполноценные антигены обладают только од­ним свойством антигена: они способны специфически взаимодействовать с теми антителами, в индукции синтеза которых они участвовали (после присоединения к белку и превращения в полноценные антигены).

Если взаимодействие неполноценного антигена с антителом сопровождается обычными иммунологическими реакциями, его называют гаптеном. Если неполно­ценный антиген имеет очень небольшую молекулярную массу и его взаимодействие с антителами не сопровождается обычными видимыми реакциями, его называют полугаптеном. О присутствии полугаптена в этом случае судят по тому признаку, что антитела, будучи связаны с полугаптеном, уже не проявляют себя в обычной реак­ции с полноценным антигеном (задерживающая реакция Ландштейнера).

15. Роль тимуса в иммунитете. Механизм дифференциации стволовых клеток в тимусе в иммунокомпетентные лимфоциты. Система Т-лимфоцитов: Т-киллеры, помощники, Т-супрессоры, Т-контрсупрессоры, их функции.

Клетки, являющиеся предшественниками Т-лимфоцитов, поступают из кровотока в тимус, где и происходит их превращение в иммунокомпетентные Т-лимфоциты под влиянием гуморальных факторов, секретируемых эпителиальными клетками тимуса; затем они покидают его и циркулируют по лимфатической и кровеносной системам, а также расселяются по лимфоидным образованиям организма.

Установлено, что для приобретения иммунокомпетентности клетки необязатель­но должны вступать в непосредственный контакт с тканью тимуса.

Решающая роль в дифференцировке предшественников Т-лим­фоцитов в иммунокомпетентные клетки принадлежит гуморальным факторам, об­разуемым тимусом.

Гуморальные факторы тимуса делят на продукты лимфоидных и продукты нелимфоидных (эпителиальных) клеток.

По характеру действия на Т-клетки гуморальные факторы тимуса делят на фак­торы активации, дифференцировки и размножения. Помимо этого, к числу важней­ших свойств пептидов тимуса относится их способность активировать продукцию лимфокинов; некоторые тимозины, а также сывороточный тимусный фактор усили­вают продукцию Т-клетками интерлейкина-2.

Тимус играет важнейшую роль не только в функционировании иммунной систе­мы и регуляции иммунного гомеостаза, но и опосредует взаимодействие иммунной системы с другими важнейшими системами организма.

По морфологическим свойствам Т- и В-лимфоциты не отличаются друг от друга. Однако они существенным образом различаются по вкладу в реакции иммунитета, по многим другим свойствам, в том числе структуре и функции рецепторов и по ан­тигенной специфичности.

Самый ответственный момент в процессе иммунного ответа - это распознавание химического маркера, свойственного «чужому» агенту и отличающегося от «своего». Эту роль выполняют макрофаги, антитела, Т- и В-лимфоциты. Антитела распознают антиген с помощью своих активных центров, а макрофаги, Т- и В-лимфоциты - благодаря имеющимся на их мембранах особым рецепторам.

Т-лимфоциты по своим функциям разделены на три суб­класса:

Т-хелперы, или Т-помощники;

Т-киллеры, или Т-цитотоксические лимфоциты;

Т-супрессоры.

Т-хелперы необходимы для превращения В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и клетки памяти. Т-киллеры разрушают клетки трансплантата, опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусными, бактериальными и другими антиге­нами. Т-супрессоры подавляют функции определенных эффекторных Т- и В-клеток и обеспечивают иммунологическую толерантность.

• 1.Медицинская микробиология. Предмет, задачи, методы, связь с другими науками. Значение медицинской микробиологии в практической деятельности врача.
• 3. Микроорганизмы и их положение в системе живого мира. Номенклатура бактерий. Принципы классификации.
• 6. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
• 7.Питание бактерий. Типы и механизмы питания бактерий. Аутотрофы и гетеротрофы. Факторы роста. Прототрофы и ауксотрофы.
• 8.Питательные среды. Искусственные питательные среды: простые, сложные, общего назначения, элективные, дифференциально-диагностические.
• 9. Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
• 13. Спирохеты, их морфология и биологические свойства. Патогенные для человека виды.
• 14. Риккетсии, их морфология и биологические свойства. Роль риккетсий в инфекционной патологии.
• 15. Морфология и ультраструктура микоплазм. Виды, патогенные для человека.
• 16. Хламидии, морфология и другие биологические свойства. Роль в патологии.
• 17. Грибы, их морфология и особенности биологии. Принципы систематики. Заболевания, вызываемые грибами у человека.
• 20. Взаимодействие вируса с клеткой. Фазы жизненного цикла. Понятие о персистенции вирусов и персистентных инфекциях.
• 21. Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов.
• 24. Строение генома бактерий. Подвижные генетические элементы, их роль в эволюции бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды изменчивости: фенотипическая и генотипическая.
• 25. Плазмиды бактерий, их функции и свойства. Использование плазмид в генной инженерии.
• 26. Генетические рекомбинации: трансформация, трансдукция, конъюгация.
• 27. Генная инженерия. Использование методов генной инженерии для получения диагностических, профилактических и лечебных препаратов.
• 28.Распространение микробов в природе. Микрофлора почвы, воды, воздуха, методы ее изучения. Характеристика санитарно-показательных микроорганизмов.
• 29. Нормальная микрофлора тела человека, ее роль в физиологических процессах и патологии. Понятие о дисбактериозе. Препараты для восстановления нормальной микрофлоры: эубиотики (пробиотики).
• 31. Формы проявления инфекции. Персистенция бактерий и вирусов. Понятие о рецидиве, реинфекции, суперинфекции.
• 32. Динамика развития инфекционного процесса, его периоды.
• 33. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность. Единицы измерения вирулентности. Понятие о факторах патогенности.
• 34. Классификация факторов патогенности по о.В. Бухарину. Характеристика факторов патогенности.
• 35. Понятие об иммунитете. Виды иммунитета.
• 36. Неспецифические защитные факторы организма против инфекции. Роль и.И. Мечникова в формировании клеточной теории иммунитета.
• 37. Антигены: определение, основные свойства. Антигены бактериальной клетки. Практическое использование антигенов бактерий.
• 38. Структура и функции иммунной системы. Кооперация иммунокомпетентных клеток. Формы иммунного ответа.
• 39. Иммуноглобулины, их молекулярная структура и свойства. Классы иммуноглобулинов. Первичный и вторичный иммунный ответ. :
• 40. Классификация гиперчувствительности по Джейлу и Кумбсу. Стадии аллергической реакции.
• 41. Гиперчувствительность немедленного типа. Механизмы возникновения, клиническая значимость.
• 42. Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения. Механизм. Их предупреждение.
• 43. Гиперчувствительность замедленного типа. Кожно-аллергические пробы и их использование в диагностике некоторых инфекционных заболеваний.
• 44. Особенности противовирусного, противогрибкового, противоопухолевого, трансплантационного иммунитета.
• 45. Понятие о клинической иммунологии. Иммунный статус человека и факторы, влияющие на него. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.
• 46. Первичные и вторичные иммунодефициты.
• 47. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Теория сетевых структур.
• 48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.
• 49. Реакция Кумбса. Механизм. Компоненты. Применение.
• 50. Реакция пассивной гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.
• 51. Реакция торможения гемагглютинации. Механизм. Компоненты. Применение.
• 53. Реакция связывания комплемента. Механизм. Компоненты. Применение.
• 54. Реакция нейтрализации токсина антитоксином, нейтрализации вирусов в культуре клеток и в организме лабораторных животных. Механизм. Компоненты. Способы постановки. Применение.
• 55. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм. Компоненты. Применение.
• 56. Иммуноферментный анализ. Иммуноблотинг. Механизмы. Компоненты. Применение.
• 57. Вакцины. Определение. Современная классификация вакцин. Требования, предъявляемые к вакцинным препаратам.
• 59. Вакцинопрофилактика. Вакцины из убитых бактерий и вирусов. Принципы приготовления. Примеры убитых вакцин. Ассоциированные вакцины. Преимущества и недостатки убитых вакцин.
• 60. Молекулярные вакцины: анатоксины. Получение. Использование анатоксинов для профилактики инфекционных заболеваний. Примеры вакцин.
• 61. Генно-инженерные вакцины. Получение. Применение. Преимущества и недостатки.
• 62. Вакцинотерапия. Понятие о лечебных вакцинах. Получение. Применение. Механизм действия.
• 63. Диагностические антигенные препараты: диагностикумы, аллергены, токсины. Получение. Применение.
• 64. Сыворотки. Определение. Современная классификация сывороток. Требования, предъявляемые к сывороточным препаратам.
• 65. Антительные препараты – сыворотки, применяемые для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Способы получения. Осложнения при применении и их предупреждение.
• 66. Антительные препараты – сыворотки, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний. Способы получения. Применение.
• 67. Понятие об иммуномодуляторах. Принцип действия. Применение.
• 68. Интерфероны. Природа, способы получения. Применение. № 99 Интерфероны. Природа, способы получения. Применение.
• 69. Химиотерапевтические препараты. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Основные группы химиотерапевтических препаратов, механизм их антибактериального действия.
• 71. Лекарственная устойчивость микроорганизмов и механизм ее возникновения. Понятие о госпитальных штаммах микроорганизмов. Пути преодоления лекарственной устойчивости.
• 72. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней.
• 73. Возбудители брюшного тифа и паратифов. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 74. Возбудители эшерихиозов. Таксономия. Характеристика. Роль кишечной палочки в норме и патологии. Микробиологическая диагностика эшерихиозов.
• 75. Возбудители шигеллеза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 76. Возбудители сальмонеллезов. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологический диагноз сальмонеллезов. Лечение.
• 77. Возбудители холеры. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профи­лактика и лечение.
• 78.Стафилококки. Таксономия. Характеристика. Микроби­ологическая диагностика заболеваний, вызываемых ста­филококками. Специфическая профилактика и лечение.
• 79. Стрептококки. Таксономия. Характеристика. Микро­биологическая диагностика стрептококковых инфек­ций. Лечение.
• 80. Менингококки. Таксономия. Характеристика. Микро­биологическая диагностика стрептококковых инфек­ций. Лечение.
• 81. Гонококки. Таксономия. Характеристика. Микробио­логическая диагностика гонореи. Лечение.
• 82. Возбудитель туляремии. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологическая диагностика. Специфическая про­филактика и лечение.
• 83. Возбудитель сибирской язвы. Таксономия и характе­ристика. Микробиологическая диагностика. Специфичес­кая профилактика и лечение.
• 84. Возбудитель бруцеллеза. Таксономия и характерис­тика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 85. Возбудитель чумы. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профи­лактика и лечение.
• 86. Возбудители анаэробной газовой инфекции. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 87. Возбудители ботулизма. Таксономия и характеристика Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 88. Возбудитель столбняка. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика и лечение.
• 89. Неспорообразующие анаэробы. Таксономия. Характе­ристика. Микробиологическая диагностика и лечение.
• 90. Возбудитель дифтерии. Таксономия и характеристика. Условно – патогенные коринебактерии. Микробиологическая диагностика. Выявления анатоксического иммунитета. Специфическая профилактика и лечение.
• 91. Возбудители коклюша и паракоклюша. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
• 92. Возбудители туберкулеза. Таксономия и характеристика. Условно – патогенные микобактерии. Микробиологическая диагностика туберкулеза.
• 93. Актиномицеты. Таксономия. Характеристика. Мик­робиологическая диагностика. Лечение.
• 95. Возбудитель хламидиозов. Таксономия. Характеристи­ка. Микробиологическая диагностика. Лечение.
• 96.Возбудитель сифилиса. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Лечение.
• 97. Возбудитель лептоспирозов. Таксономия. Характери­стика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика. Лечение.
• 98. Возбудитель боррелиозов. Таксономия. Характерис­тика. Микробиологическая диагностика.
• 99. Клиническая микробиология, ее задачи. Вби, особенности причины возникновления.Роль условно – патогенных микроорганизмов в возникновении внутрибольничных инфекций.
• 100. Классификация грибов. Характеристика. Роль в патологии. Лабораторная диагностика. Лечение.
• 101. Классификация микозов. Поверхностные и глубокие микозы. Дрожжеподобные грибы рода кандида. Роль в патологии человека.
• 102. Возбудитель гриппа. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилакти­ка и лечение.
• 103. Возбудитель полиомиелита. Таксономия и характери­стика. Лабораторная диагностика. Специфическая про­филактика.
• 104. Возбудители гепатитов а и е. Таксономия. Характе­ристика. Лабораторная диагностика. Специфическая про­филактика.
• 105. Возбудитель клещевого энцефалита. Таксономия. Ха­рактеристика. Лабораторная диагностика. Специфичес­кая профилактика.
• 106. Возбудитель бешенства. Таксономия. Характеристи­ка. Лабораторная диагностика. Специфическая профи­лактика.
• 107. Возбудитель краснухи. Таксономия. Характеристика. Лабораторная диагностика. Специфическая профилак­тика.

47. Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Теория сетевых структур.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы: 1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут; 2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов. Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов - агглютинации ,преципитации , лизиса . Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Рис. 1. Схема взаимодействия антигена с антителами.

Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности ) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела. Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (см. реакцию Кумбса).

48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя , выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.