Помощь по Теле2, тарифы, вопросы

Эмиль фон Беринг

Антиген - вещества, способные вызывать иммунный ответ, выработку антител.

Классификация по происхождению: естественные АГ, искусственные АГ; АГ, полученные в результате ГМ естественных АГ; синтетические АГ.

По химическому составу – это 1)белки. Минимум, 8 АК. Но всё, что меньше 20 АК вызывает иммунную реакцию с очень низкой вероятностью. 2)углеводы. 3)НК. 4) некоторые липиды – стероиды НП, холестерин, а вот триглицериды (сильно биполярные) – оч плохие АГ, к ним АТ не вырабатываются.

По отношениям пары донор-реципиент: 1) ауто-АГ (своего организма), 2)изо-АГ (от генетически-идентичной особи: клон или близнец), 3)алло-АГ (того же вида)вероятность такого контакта у взрослого человека в природных условиях крайне мала, встречается, например, при переливании крови. У колониальных асцидий – легко4)ксено-АГ(другого вида) – всё остальное! – мыши, коровы, вирусы, бактерии. Итого, самое интересно – это ауто- и ксено-АГ.

Антигенность – мера антигенного качества, способность вызывать большую или меньшую продукцию АТ.

Иммуногенность – это способность создавать состояние иммунитет, т.е.е невосприимчивости организма при повторном контакте с антигеном.

Самый яркий пример, когд а2 эти свойства не совпадают – это сальмонелла. Продукция АТ огромна, а вот иммунитет против неё не вырабатывается. +ИППП (инф, передающиеся половым путем).

Иммуногенность связана с наличием на поверхности АГ т.н. антигенных детерминант (=эпитопов).

Г-н Карл Ландштейнер (NP1930г). Опыт:

МАБС – метааминобензолсулфонат – вводили мышам – не было никакого эффекта.

МАБС сшили с белком овальбумуном – ввели мышам – получили два типа антител: к овальбумину и к МАБС.

Термины: «гаптен» и «носитель». Гаптен – маленькая группировка, с которой происходит связывание АТ, тут и возникло понятие эпитопа. Итак, чем больше размер и чем большую гетерогенность имеет молекула АГ, тем сильнее будет ответ. Т.е иммунный ответ вызывается не всей молекулой, а определенными группировкам на её поверхности.

Другой опыт Ландштейнера:

Пришивал боковые группировки в разные позиции МАБС (орто/мета/пара)

Мышь иимунизировали конъюгатом овальбумин-МАБС. А проявлял АТ, вводя разные вещества (см.таблицу). Самое сильное связывание – в мета-положении.

Показано, что АТ специфичны к очень маленькой группировке, которая достаточно точно соответствует структуре паратопа (АГ-распознающего участка). Так, размер этой группировки (эпитопа) оч небольшой. Разные участки одной молекулы могут выполнять функции и носителя, и гаптена.

Пространственные (или криптальные) АГ.

Молекулы Антител состоят из двух белковых цепей: тяжелой и легкой. Они относятся к фракции γ-глобулинов сыворотки крови.

Портер и Эдельман, 1960е. Определили АК, нуклеотидную последовательности. Построили модели с помощью рентгено-структурного анализа. Показали, что ИГ состоит из двух тяжелый Н и двух легкий цепей L. Цепи состоят из ИГ-доменов, внутри каждого домена альфа-спиральные бета-складчатые участки, и в каждом домене есть как минимум одна дисульфидная связь. Тяж и легкие цепи связаны двумя дисульфидными связями, а тяжелые цепи между собой связаны переменным числом дисульфидных связей. Место соединения Л и Т цепей – шарнирный участок.

Изменениям подвержены только вариабельные участки VHиVL.

Типы тяжелых цепей: (в порядке открытия)

γ-цепь – IgG(4 домена)

μ – IgM(5доменов)

α – IgA(4 домена)

δ – IgD(4 домена)

ε – IgE (5 домена)

Связывание компонентов С’ происходит между 2 и 3м доменами. С С2-доменом IgGсвязаны сайты гликозилирования – эта зона шарнирного участка прикрывается. Наличие углеводного компонента приводит к вариабельности массы различных антител с разницей до 30кДа.

Несколько конформаций структуры паратопа.

Pocket– распознавание пептидов, длиной максимум 7 АК, обычно = 3-5АК.

• Расширенная поверхность (например, распознавание лизоцима)

  Исходно все эти три модели были выведены математически – а позже подтверждены экспериментально.

(картинка)

CDR–Complementarydeterminedregion– участки, определяющие комплементарность – термин касается зоны соприкосновения с АГ. В пределахCDRмогут меняться разные кусочки. Так, на тяжелой цепи триCDR, на легкой – два. Т.е. меняется не весь антиген, а только эти участки (на уровне гена - гипермутации).

К этой группе иммунологической недостаточности относятся состояния, обусловленные тяжелыми воспалительными и токсическими процессами, дефицитом белков, в том числе иммуноглобулинов, в результате обильных и длительных кровотечений; у новорожденных вследствие слабой активности иммунологической системы может возникнуть транзиторная иммунологическая недостаточность.

Выявлена аутосомно-рецессивная форма комбинированной иммунологической недостаточности (синдром Луи-Бар), при которой глубоко нарушены функции Т- и В-систем иммунитета; она сцеплена с полом (болеют мальчики) и является следствием нарушения белкового обмена.

Прт иммунологической недостаточности отмечено резкое повышение частоты злокачественных опухолей.

При частом введении антигена или при введении его в больших дозах может наступить иммунизаторное торможение, при котором организм не будет отвечать на действие антигена дальнейшей выработкой иммунитета. При одновременном введении в организм сильного и слабого антигенов может возникать угнетение ответа на слабый антиген.

При избытке антигена, введенного в организм, наступает иммунологический паралич. Организм утрачивает способность иммунизироваться заведомо вакцинирующими дозами. Предполагают, что иммунологический паралич обусловлен связыванием антител с антигеном, длительно сохраняющимся в организме. При этом наступает блокада лимфоидно-макрофагальной системы.

На образование антител большое влияние оказывают питание, ионизирующая радиация, продукция гормонов, охлаждение и перегревание, интоксикация. При голодании или неполноценном белковом питании продукция антител снижается. Состояние гиповитаминоза также задерживает синтез антител. Наиболее чувствительными к действию ионизирующей радиации являются клетки в индуктивной фазе продукции антител, т. е. в период фиксации клетками антигена. Состояние стресса обусловливает резкое снижение общей резистентности организма, включая и гуморальный иммунитет. Выработка антител к возбудителям инфекционных болезней в ряде случаев снижается под влиянием антибиотиков, вводимых с целью лечения больных в ранних стадиях заболевания.

Таким образом, для максимального развития иммунитета определенное значение имеют химический состав, физико-химические свойства, условия введения, интервалы и доза антигена, состояние организма и внешняя среда.

Существующие в настоящее время теории образования антител пытаются объяснить этот сложный процесс с различных точек зрения.

Рис. 1. Образование антител.

1 — под контролем антигена, выполняющего функцию матрицы; 2—под контролем генов клонов плазмоцитов.

Согласно теории прямой матрицы Гауровитца — Полита, антигены проникают в поле белкового синтеза клетки — в рибосомы (рис. 1). Контакт с новообразующимися молекулами иммуноглобулина приводит к изменению первичной и вторичной его структур, в результате чего он приобретает специфическое сродство к антигену и становится антителом.

Теория непрямой матрицы Бернета—Феннера предполагает, что антиген, действуя на ДНК или РНК, специфически изменяет саморегулирующиеся нуклеопротеидные структуры клетки. Антиген в данном случае, возможно, выполняет функцию индуктора при синтезе адаптивных ферментов, растормаживая естественно репрессированные иммунологические способности клетки.

По теории естественной селекции Ерне антитела образуются в результате селекции нормальных антител. Антиген соединяется в организме с соответствующими нормальными антителами, образующийся комплекс антиген — антитело поглощается клетками, которые и вызывают выработку антител.

Клоналъно-селекционная теория -Бернета предусматривает, что популяция лимфоидных клеток генетически гетерогенна, каждый клон клеток (В-лимфоцитов) обладает различным сродством к антигенам. Вследствие контакта с антигеном клоны клеток, обладающие наибольшим сродством к нему, интенсивно пролиферируют, трансформируясь в плазматические клетки, продуцирующие антитела. Согласно этой теории, под влиянием антигенов происходит селекция иммунокомпетентных клеток. В результате иммунизации могут возникнуть мутации данного клона с последующей их пролиферацией. Эта теория в большей степени объясняет ранее неизвестные явления в иммунологии, однако она не в состоянии раскрыть механизм предсуществования многочисленных клеточных клонов, заранее готовых продуцировать иммуноглобулины.

Таким образом, образование антител подчиняется закономерностям биосинтеза белков, происходит в рибосомах плазматических клеток и контролируется системой ДНК — РНК клетки. Антиген, вероятно, выполняет пусковую функцию, не принимая затем участия в образовании антител.

В общем комплексе механизмов невосприимчивости специфические и неспецифические, клеточные и гуморальные защитные реакции представляют собой эффективную систему, обеспечивающую сохранение постоянства внутренней среды макроорганизма. Они проявляются на молекулярном, клеточном и организменном уровнях, что наделяет их широким диапазоном действия на патогенные агенты.

Наряду с защитными функциями иммунные реакции в ряде случаев могут обусловливать возникновение патологических состояний: аутоиммунных процессов, аллергии и др.

Антитела - белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена (гаптеном).

Защитная роль А. как факторов гуморального иммунитета обусловлена их антигенраспознающей и антигенсвязывающей активностью и рядом эффекторных функций: способностью активировать систему комплемента, взаимодействовать с различными клетками, усиливать фагоцитоз. Эффекторные функции А. реализуются, как правило, после их соединения с антигеном, вслед за которым происходит удаление чужеродного агента из организма. При инфекциях появление в крови больного А. против возбудителя инфекции свидетельствует о сопротивлении организма данной инфекции, а уровень антител служит мерой напряженности иммунитета.

Впервые появление в крови у животных веществ, которые специфически взаимодействовали с введенными ранее токсинами бактерий, обнаружили в 1890 г. Беринг и Китасато (Е. Behring, S. Kitasato). Вещество вызывало обезвреживание токсина и было названо антитоксином. Более общий термин «антитела» был предложен, когда выявили возникновение подобных веществ при введении в организм любых чужеродных агентов. Первоначально о появлении и накоплении А. судили по способности исследуемых сывороток давать при соединении с антигенами видимые серологические реакции или по их биологической активности - способности нейтрализовать токсин, вирус, лизировать бактерии и чужеродные клетки. Предполагали, что каждому феномену соответствуют особые А. Однако впоследствии оказалось, что тип антиген - антитело реакции определяется физическими свойствами антигена - его растворимостью, а антитела разной специфичности и видового происхождения принадлежат к гамма-глобулиновой фракции крови или, по номенклатуре ВОЗ, к иммуноглобулинам (lg). Иммуноглобулины - это совокупность сывороточных белков, несущих активность антител. Позже была обнаружена гетерогенность по физико-химическим свойствам и сродству к антигену антител одной специфичности, выделенных от одного индивида, и показано, что они синтезируются в организме разными клонами плазматических клеток. Важным шагом в изучении строения антител стало использование с этой целью миеломных белков - гомогенных иммуноглобулинов, синтезируемых одним клоном плазматических клеток, подвергшихся малигнизации.

Классы иммуноглобулинов и их физико-химические свойства. Иммуноглобулины составляют около 30% всех белков сыворотки крови. Их количество значительно возрастает после антигенной стимуляции. Антитела могут принадлежать к любому из пяти классов иммуноглобулинов (lgA, lgG, lgM, lgD, lgE). Молекулы иммуноглобулинов всех классов построены из ептидных цепей двух видов: легких (L) с молекулярной массой около 22000, одинаковых для всех классов иммуноглобулинов, и тяжелых (Н) с молекулярной массой от 50000 до 70000 в зависимости от класса иммуноглобулина. Структурные и биологические особенности каждого класса иммуноглобулинов обусловлены особенностями строения их тяжелых цепей. Основной структурной единицей иммуноглобулинов всех классов является димер двух идентичных пар легкой и тяжелой цепей (L-Н) 2 .

Иммуноглобулин G (lgG) имеет молекулярную массу около 160000, молекула состоит из одной (L-Н) 2 -субъединицы и содержит два антигенсвязывающих центра. Это основной класс антител, составляющий до 70-80% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови. Концентрация lgG в сыворотке крови 6-16 г/л . В процессе первичного иммунного ответа (после первичного введения антигена) он появляется позднее lgM-антител, но образуется раньше при вторичном иммунном ответе (после повторного введения антигена). lgG - единственный класс антител, которые проникают через плаценту и обеспечивают иммунологическую защиту плода, активируют систему комплемента, обладают цитофильной активностью. Благодаря высокому содержанию в сыворотке крови lgG имеет наибольшее значение в противоинфекционном иммунитете. Поэтому об эффективности вакцинации судят по наличию его в сыворотке крови.

Иммуноглобулин М (lgM) имеет молекулярную массу 900000. молекула состоит из 5 (L-Н) 2 -субъединиц, скрепленных дисульфидными связями и дополнительной пептидной цепью (J-цепь). lgM составляет 5-10% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови; концентрация его в сыворотке крови 0,5-1,8 г/л . Антитела этого класса образуются при первичном иммунном ответе, Молекула lgM содержит 10 активных центров, поэтому lgM особенно эффективен против микроорганизмов, содержащих в мембране повторяющиеся антигенные детерминанты. lgM обладает высокой агглютинирующей активностью, сильным опсонизирующим эффектом, активирует систему комплемента. В виде мономера является антигенсвязывающим рецептором В-лимфоцитов.

Иммуноглобулин A (lgA) составляет 10-15% от сывороточных иммуноглобулинов; концентрация его в сыворотке 1-5 г/л крови. lgA существует в виде мономера, димера, тримера (L-Н) 2 -субъединицы. В виде секреторного lgA (slgA), устойчивого к протеазам, является основным глобулином экстраваскулярных секретов (слюны, слезной жидкости, носового и бронхиального секретов, поверхности слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта). lgA-антитела обладают цитофильной активностью, агглютинируют бактерии, активируют систему комплемента, нейтрализуют токсины, создают защитный барьер в местах наиболее вероятного проникновения инфекционных агентов. Уровень lgA в сыворотке крови возрастает при перинатальных инфекциях, заболеваниях дыхательных путей.

Иммуноглобулин Е (lgE) имеет вид мономера (L-Н) 2 -субъединицы и молекулярную массу около 190000. В сыворотке крови содержится в следовых количествах. Обладает высокой гомоцитотропной активностью, т.е. прочно связывается с тучными клетками соединительной ткани и базофилами крови. Взаимодействие связанных с клетками lgE с родственным антигеном вызывает дегрануляцию тучных клеток, высвобождение гистамина и других вазоактивных субстанций, что приводит к развитию гиперчувствительности немедленного типа. Ранее антитела lgE-класса назывались реагинами.

Иммуноглобулин D (lgD) существует в виде мономерного антитела с молекулярной массой около 180000. Концентрация его в сыворотке крови 0,03-0,04 г/л . lgD в качестве рецептора присутствует на поверхности В-лимфоцитов.

Структура антител и их специфичность . Общий план строения макромолекулы обычно рассматривают в отношении lgG-антател. включающих одну (L-Н) 2 -субъединицу. При ограниченном протеолизе папаином молекулы А этого класса распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Каждый Fab-фрагмент содержит по одному активному центру, или антидетерминанте, т.к. соединяется с антигеном, но не может его преципитировать. В организации активного центра принимают участие вариабельные участки легкой и тяжелой цепей.

Fc-фрагмент не связывает антиген. В его состав входят константные участки тяжелых цепей. В Fc-фрагменте расположены центры, ответственные за эффекислоторные функции, общие для всех А. одного класса. Схематически молекулу lgG-антител можно представить в виде буквы Y, верхние плечи которой составляют идентичные Fab-фрагменты, а нижний отросток является Fc-фрагментом.

Иммунная система позвоночных способна синтезировать 10 5 - 10 8 молекул А. разной специфичности. Специфичность - важнейшее свойство А., позволяющее им избирательно реагировать с тем антигеном, которым был стимулирован организм. Специфичность А. определяется уникальностью строения антидетерминанты и является результатом пространственного соответствия (комплементарности) между детерминантой антигена и аминокислотными остатками, выстилающими полость анти-детерминанты. Чем выше комплементарность, тем большее число нековалентных связей возникает между детерминантой антигена и аминокислотными остатками антидетерминанты и тем прочнее, стабильнее образующийся иммунный комплекс. Различают аффинность антител, которая является мерой прочности связывания одной антидетерминанты с детерминантой, и авидность антител - суммарную силу взаимодействия поливалентного А. с полидетерминантным антигеном. Хотя А. способны различать незначительные изменения в структуре антигена, известно, что они могут реагировать и с детерминантами сходной структуры. Антитела одной специфичности представлены пулом молекул с разной молекулярной массой, электрофоретической подвижностью и разным сродством к антигену.

Для получения однородных по специфичности и сродству к антигену антител применяют гибридому - гибрид моноклона антителопродуцирующей клетки с клеткой миеломы. Гибридома приобретает способность продуцировать в неограниченном количестве моноклональные А., абсолютно идентичные по классу и типу молекул, по специфичности и сродству к антигену. Моноклональные А. - наиболее перспективное диагностическое и лечебное средство.

Виды антител и их синтез. Различают полные и неполные А. Полные А. имеют в молекуле не менее двух активных центров и при соединении с антигенами дают видимые серологические реакции. Могут быть тепловые и холодовые полные А., которые реагируют с антигеном соответственно при t° 37° или при 4°. Известны двухфазные, биотермические А. Они соединяются с антигеном при низких температурах, а видимый эффект соединения проявляется при 37°. Полные А. могут принадлежать ко всем классам иммуноглобулинов. Неполные А. (моновалентные, непреципитирующие, блокирующие, агглютиноиды) содержат в молекуле одну антидетерминанту вторая антидетерминанта или замаскирована, или обладает низкой аффинностью.

Неполные А. не дают при соединении с антигеном видимых серологических реакций. Их выявляют по способности блокировать реакцию специфического антигена с полными А. той же специфичности либо с помощью антиглобулинового теста - так называемые пробы Кумбса. К неполным А. относятся антитела к резус-фактору.

Нормальные (естественные) А. обнаруживают в крови животных и человека при отсутствии явной инфекции или иммунизации. Антибактериальные нормальные А. возникают, вероятно, в результате постоянного, незаметного контакта с данными бактериями. Предполагают, что они могут определять индивидуальную устойчивость организма к инфекциям. К нормальным А. относят изоантитела, или алло-антитела (см. Группы крови ). Нормальные А., как правило, представлены lgM.

Синтез молекул иммуноглобулинов осуществляется в плазматических клетках. Тяжелые и легкие цепи молекулы синтезируются на разных хромосомах и кодируются разными наборами генов.

Динамика выработки А. в ответ на антигенный стимул зависит от того, впервые или повторно организм сталкивается с данным антигеном. При первичном иммунном ответе появлению А. в крови предшествует латентный период продолжительностью 3-4 дня. Первые образующиеся А. принадлежат к lgM. Затем количество А. резко возрастает и происходит переключение синтеза с lgM- на lgG-антитела. Максимум содержания А. в крови приходится на 7-11-е сутки, после чего их количество постепенно снижается. Для вторичного иммунного ответа характерны укороченный латентный период, более быстрое нарастание титров А. и большее их максимальное значение. Характерно образование сразу lgG-антител. Способность к иммунному ответу по вторичному типу сохраняется в течение многих лет и представляет собой проявление иммунологической памяти, примерами которой может служить противокоревой и противооспенный иммунитет.

Современные теории образования антител . Образование А. является результатом межклеточного взаимодействия, возникающего под влиянием иммуногенного стимула. В клеточной кооперации участвуют три типа клеток: макрофаги (А-клетки). лимфоциты тимусного происхождения (Т-лимфоциты) и лимфоциты костномозгового происхождения (В-лимфоциты). Т- и В-лимфоциты имеют на своей поверхности генетически детерминированные рецепторы для антигенов самой разнообразной специфичности. Т о., распознавание антигена сводится к отбору (селекции) клонов Т- и В-лимфоцитов, несущих рецепторы данной специфичности. Иммунный ответ осуществляется по следующей схеме. Антиген, попадая в организм, поглощается макрофагами и перерабатывается ими в иммуногенную форму, которая распознается иммуноглобулиноподобными рецепторами Т-лимфоцитов (помощников), специфичными к данному антигену. Молекулы антигена, связанные с иммуноглобулиновыми рецепторами, отрываются от Т-лимфоцитов и присоединяются к макрофагам через Fc-рецепторы иммуноглобулинов. На макрофагах образуется таким способом «обойма» антигенных молекул, которая распознается специфическими рецепторами В-лимфоцитов. Только такой массированный сигнал может вызвать пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцита (предшественника) в плазматическую клетку. Следовательно, Т- и В-лимфоциты распомают различные детерминанты на одной молекуле антигена. Клеточная кооперация возможна лишь при наличии двойного распознавания.

Феномен двойного распознавания заключается в том, что Т- и В-лимфоциты распознают чужеродную антигенную детерминанту только в комплексе с продуктами генов основного комплекса гистосовместимости своего организма. Известно, что клеточной кооперации между аллогенными клетками не происходит. Вероятно, ассоциация антигенной детерминанты со своими поверхностными структурами осуществляется на поверхности макрофагов в процессе переработки антигена в иммуногенную форму, а также на поверхности лимфоцитов.

Выделение антител и их очистка . Различают неспецифические и специфические методы выделения А. К неспецифическим относят методы фракционирования иммунных сывороток, в результате которых получают фракции, обогащенные А., чаще всего фракцию lgG-антител. К ним относятся высаливание иммуноглобулинов сернокислым аммонием или сернокислым натрием, осаждение иммуноглобулинов спиртом, методы препаративного электрофореза и ионообменной хроматографии и гель-хроматографии. Специфическая очистка основана на выделении А. из комплекса с антигеном и приводит к получению А. одной специфичности, но гетерогенных по физико-химическим свойствам. Процедура состоит из следующих этапов: получение специфического преципитата (комплекса антиген - антитело) и отмывка его от остальных компонентов сыворотки; диссоциация преципитата; отделение А. от антигена на основе различий в их молекулярной массе, заряде и других физико-химических свойств. Для специфического выделения А. широко используют иммуносорбенты - нерастворимые носители, на которых фиксирован антиген. В этом случае процедура получения А. значительно упрощается и включает пропускание иммунной сыворотки через колонку с иммуносорбентом, отмывку иммуносорбента от несвязавшихся белков сыворотки, элюцию фиксированного на иммуносорбенте А. при низких значениях рН и удаление диссоциирующего агента путем диализа.

Библиогр.: Вейсман И.Л., Худ Л.Е. и Вуд У.Б. Введение в иммунологию, пер. с англ., с. 13, М., 1983; Иммунология, под ред. У. Пола, пер. с англ., с. 204, М., 1987; Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология, М., 1985; Образование антител, под ред. Л. Глинна и М. Стьюарда, пер. с англ., с. 10, М., 1983, Петров Р.В. Иммунология, с. 35, М., 1987.

Работы Ландштайнера, Полинга

Инструктивная теория – механизм образования специфических антител обусловлен инструктивным действием антигенов. Развивались с 1900 по 1940 годы. Сложилось убеждение, что именно антиген управляет образованием специфических антител, направляя механизмы белкового синтеза на изготовление тех уникальных молекулярных конфигурации, которые определяют иммунологическую специфичность. Тем или иным способом антиген должен передать новообразованной молекуле белка информацию о своей специфичности, чтобы придать этой молекуле функции антитела.

Работа Ф. Брейнлема

Наиболее известная из этих инструктивных теорий, созданная в 1930 г. Ф. Брейнлем и Ф. Гауровицем (F. Breinl, F. Haurowitz), утверждала, что антиген играет роль матрицы, которая обеспечивает сборку уникальных аминокислотных последовательностей полипептидной цепи антител. Позднее инструктивная теория была развита Лайнусом Полингом (Linus Pauling), поддержавшим ее всем авторитетом, которым он пользовался в области физической химии. Утверждалось, что антиген может служить тем шаблоном, на котором происходит свертывание предобразованной полипептидной цепи с возникновением соответствующей третичной конфигурации, заключающей в себе стереохимическую специфичность. В течение нескольких десятилетий подобные теории прямой матрицы пользовались большой популярностью, так как казалось, что они предлагают единственное разумное объяснение тому многообразию антител, которое, как показали Ландштейнер (Landsteiner) и другие, может образовываться в организме позвоночных.

Не будь антитела, не сформируются вариации к нему. В течение нескольких десятилетии подобные теории пользовались популярностью, так как казалось, что они предлагают 1 разумное объяснение тому разнообразию антител, которое, как показал Ландштейнер, может образовываться в организме позвоночных. Но биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигенов и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный ответ. Эти теории совсем не могли объяснить, почему при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к снижению специфичности, а в других – к значительному расширению. С точки зрения биологии, теории матрицы обладали недостатками, что и привело вирусолога Бернета к созданию в 1941 году другого варианта инструктивной теории. Он предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые не обходимо для синтеза глобулина, вызывая в результате образования уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов объясняла не только широту иммунологического репертуара, но длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела.

Однако, исходя из этих химических теорий, биологи не могли представить, каким образом образование антител может продолжаться при видимом отсутствии антигена, и даже не пытались понять, почему повторное введение антигена должно вызывать вторичный (бустерный) ответ. Более того, эти теории совсем не могли объяснить последних данных о том, что при повторной иммунизации происходит изменение качества антител, которое в одних случаях приводит к сужению специфичности, а в других - к значительному расширению диапазона перекрестных серологических реакций.

С развитием представлений о возможной генетической роли НК Бернет и Феннер в 1949 году предложили модификацию этой теории: антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном. Это приводит затем к образованию не прямой матрицы для специфических антител. Новая копию гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.

С точки зрения биолога, теории матрицы обладали значительными недостатками, и именно это привело вирусолога Макфарлейна Бернета (Macfarlane Burnet) к созданию в 1941 г. другого варианта инструкционистской теории. В условиях растущего признания той роли, которую ферменты играют в процессах синтеза и расщепления, Бернет предположил, что функция антигена может заключаться в том, что он стимулирует адаптивную модификацию тех ферментов, которые необходимы для синтеза глобулина, вызывая в результате образование уникальной белковой молекулы с нужной специфичностью. Эта теория адаптивных ферментов имела то преимущество, что с позиций первичной инструктивной роли антигена она объясняла не только широту иммунологического репертуара, но и длительное образование антител и усиленный вторичный иммунный ответ. Предполагалось, что эти явления связаны с репликацией адаптивных ферментов в увеличивающейся популяции пролиферирующих дочерних клеток, которые сохраняют способность образовывать антитела. Этот последний момент имеет особое значение, поскольку Бернет (Burnet) является, по-видимому, первым, кто подчеркнул важную роль длительного функционирования клеток и клеточной пролиферации в процессе образования антител.

С развитием представлений о возможной генетической роли нуклеиновых кислот Бернет и Франк Феннер (Burnet, Frank Fenner) в 1949 г. предложили модификацию этой теории, по-прежнему исходя из биологических соображений. На этот раз они предположили, что антиген может вносить информацию о своей специфической детерминанте прямо в геном (РНК). Это приводит затем к образованию непрямой матрицы для специфических антител. Новая копия гена будет не только сохраняться в клетке, но в условиях клеточной пролиферации будет воспроизводиться в дочерних клетках, что и объясняет длительное антителообразование и повышенную интенсивность вторичного ответа.



Антитело - это молекула, без которой невозможно представить современную науку и медицину. Она играет ключевую роль как во многих методиках экспериментальной науки, так и при диагностике различных заболеваний. Лекарства на основе антител изменили облик фарминдустрии и продолжают будоражить мир всё новыми и новыми перспективами. Между тем, эта область знаний проделала сложный и увлекательный путь, в котором рука об руку шли фундаментальная и прикладная науки, над которой работали гениальные исследователи и где совершались воистину великие открытия. Мы расскажем об основных вехах изучения антител, а также об их применении в медицине и науке. Данная статья открывает цикл работ, посвященных моноклональным антителам.

Спецпроект об антителах, истории их изучения, методах работы с ними, а также о применении антител в современной медицине и биотехнологии.

Партнер спецпроекта - Департамент вычислительной биологии одной из крупнейших российских биотехнологических компаний - . BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.

Глава 1. Краткая история открытия антител: от XIX века до наших дней

Начало: история разработки сыворотки против дифтерии

Ко второй половине XIX века в зарождающейся науке иммунологии накопилось достаточно данных об иммунизации - способности организма противостоять возбудителю заболевания при повторной встрече с ним. Знаковую роль здесь сыграла разработка Эдвардом Дженнером и широкое распространение первой эффективной вакцины против натуральной оспы в конце XVIII - начале XIX веков. Дженнер использовал содержимое пустул больных коровьей оспой, неопасной для людей, для получения иммунитета против натуральной оспы (рис. 1). Вкратце с этой историей можно познакомиться на сайте «История медицины ».

Со временем пришло понимание, что вещества иммунизированного организма, помогающие ему не заболеть при повторном контакте с возбудителем заболевания, содержатся в жидкой части крови - сыворотке . Сыворотку можно вводить в организм, никогда с возбудителем не контактировавший, и добиваться его защиты на некоторое время, а также вылечить уже больной организм!

В 1888 году Эмиль Ру и Александр Йерсен открыли растворимый токсин дифтерийной палочки . Иммунизация лабораторных животных данным токсином приводила к образованию вещества, обезвреживающего его - так называемого антитоксина, который составлял действующую основу сыворотки. Важным моментом стало понимание того, что иммунный ответ направлен не на микроорганизм в целом, а на его часть - будь то растворимое секретируемое вещество или элемент структуры. Позднее термин «токсин» сменился на более широкий термин «антиген », а «антитоксин» - на «антитело ».

В 1890 году вышел в свет совместный труд немецкого врача-исследователя Эмиля Адольфа фон Беринга (рис. 2) и японского исследователя-микробиолога Китасато Сибасабуро «О развитии иммунитета против дифтерии и столбняка у животных », в котором они показали, что сыворотка крови кроликов, инфицированных столбнячной палочкой , способна защитить мышей от живых столбнячных бацилл и столбнячного токсина. Через неделю Беринг опубликовал об аналогичных защитных свойствах сыворотки крови морских свинок, иммунизированных инактивированными возбудителями дифтерии и дифтерийным токсином. Свою работу Беринг завершил довольно громким заявлением: «Таким образом, возможность лечения даже самых тяжелых заболеваний больше не может быть проигнорирована» .

Приведенные выводы вызвали общественный резонанс. Столбняк - заболевание с контактным путем передачи и высокой летальностью - являлся в то время частой причиной смерти детей и военнослужащих (к слову, бóльшую обеспокоенность вызывало последнее, несмотря на факты и статистику). Вопрос дифтерии также стоял достаточно остро. Отсутствие эффективных методов ее лечения приводило к тому, что практически каждый двадцатый ребенок в Европе и США умирал от этой болезни.

В январе 1892 года Беринг начал первое исследование антидифтерийной сыворотки на людях. Старт был дан в рождественскую ночь 1891 года, когда маленькой умирающей девочке в хирургическом отделении Берлинского детского госпиталя Бергманна произвели первую инъекцию спасительной сыворотки.

Технология, однако, имела ограниченный потенциал для проведения больших исследований, повысить который Берингу удалось в сотрудничестве с Паулем Эрлихом . Для получения сыворотки ученые начали использовать вместо кроликов более крупных животных (лошадей), благодаря чему удавалось получать бóльшее количество сыворотки. Кроме того, методика иммунизации стандартизовали и, соответственно, она стала пригодной для проведения клинических исследований.

В первых крупных наблюдениях, опубликованных в 1894 году, приведены результаты по лечению «чудо-сывороткой» 220 детей, из которых выжили целых 77% - невиданная для тех лет цифра. Если лечение начиналось в первые два дня, то выживаемость стремилась к 100%, если же на шестой день - успех ожидался лишь в 50% случаев. Совершенствуя сыворотку, Берингу удалось снизить смертность до 1–5% в случае своевременной диагностики заболевания.

Беринг считал свою сыворотку абсолютно безвредной, но, к сожалению, это было не совсем так. В 1896 году здоровому ребенку, который имел контакт с домработницей, заболевшей дифтерией, с профилактической целью была введена сыворотка. В ответ на это у мальчика развился анафилактический шок , и ребенка спасти не удалось. Волей судьбы, отец мальчика оказался известным патологоанатомом, который позднее задокументировал этот первый летальный случай, связанный с введением сыворотки.

Для Беринга это самое начало пути - он будет трудиться не только над проблемой лечения дифтерии, но также достигнет значительных успехов в вопросах вакцинации. Проведя колоссальную работу по разработке препарата фактически «от идеи к пациенту», Беринг заложил основы проведения доклинических и клинических исследований препаратов такого рода (про то, как устроены современные клинические исследования, можно почитать в посвященном этому спецпроекте). Яркую и плодотворную деятельность Беринга в 1901 году отметили Нобелевской премией с формулировкой «за работу по сывороточной терапии, главным образом за её применение при лечении дифтерии, что открыло новые пути в медицинской науке и дало в руки врачей победоносное оружие против болезни и смерти » .

Середина: селективная теория «боковых цепей» Пауля Эрлиха

В 1896 г. Грубер и Дархэм открыли феномен агглютинации бактерий , а в 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации (образования комплекса) между антигеном и антителом, что дало возможность качественно и количественно изучать реакцию «антиген-антитело». Этим занялся Пауль Эрлих , выдающийся немецкий ученый, врач, микробиолог, один из основоположников иммунологии и химиотерапии (рис. 3). Эрлих разработал принцип количественного определения антител и антигенов методом титрования, что сейчас является необходимым условием стандартизации, а также заложил основы понимания специфичности взаимодействия антиген-антитело. Кроме того, в своей работе 1897 года «Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы» Пауль Эрлих впервые озвучил гипотезу образования антител, получившую название теории «боковых цепей» (рис. 4) .

Эрлих полагал, что антитело - это особый вид молекул, расположенных в виде рецепторов («боковых цепей») на поверхности клеток. Боковые цепи благодаря своей особой конфигурации, комплементарной (то есть полностью соответствующей ей) молекуле антигена, способны взаимодействовать с ней по принципу «ключ-замок», причем необратимым способом. Это взаимодействие специфическое, а на поверхности клеток исходно существует некий репертуар таких «боковых цепей». Антиген же способен отбирать специфичные ему рецепторы, которые далее открепляются от поверхности клетки, циркулируют в крови в поиске «своего» антигена и в конечном счете инактивируют его.

Простая и лаконичная теория Эрлиха быстро была подхвачена научными кругами, надолго определив вектор иммунологической мысли. Тем не менее через пару десятилетий в ней обнаружили бреши. Неразрешенные вопросы в первую очередь касались специфичности образующихся антител, так как со временем обнаружили, что антитела вырабатываются не только против возбудителей заболеваний, но и против безвредных веществ, в том числе собственных молекул организма и даже небольших химических соединений.

Рисунок 4. Теория «боковых цепей». На иммунной клетке присутствует репертуар боковых цепей, с которыми взаимодействует токсин по принципу «ключ-замок». Данное взаимодействие приводит к синтезу большого количества боковых цепей определенной специфичности, которые открепляются от поверхности в виде растворимых боковых цепей, циркулируют по кровотоку и нейтрализуют токсин.

Большой вклад в изучение репертуара антигенов внес Карл Ландштейнер . В начале ХХ века он показал существование антител к собственным антигенам организма - белкам на поверхности эритроцитов - и таким образом открыл существование групп крови , за что был удостоен Нобелевской премии (1930) . А в 1923 году Карл Ландштейнер открыл гаптены - класс низкомолекулярных соединений, иммунный ответ на которые не вырабатывается. Если же такое соединение связывалось с собственными белками организма (например, альбумином в крови или рецепторами на поверхности клеток), то на подобный комплекс начинали образовываться антитела.

Выработки антител можно было достичь и к откровенно «искусственным» соединениям, встреча с которым в природе полностью исключена - так, Ландштейнер получил антитела к динитрофенилу. Стало понятно, что о предсуществовании хоть и разнообразного, но заведомо ограниченного репертуара антител не могло идти и речи. Интуитивно понятным становилось предположение, что живой организм способен каким-то образом «прочитывать» структуру антигена и далее синтезировать комплементарные ему антитела. Заметим, что структуру молекулы ДНК расшифровали лишь в 1953 году, а центральную догму молекулярной биологии «ДНК → РНК → белок» Фрэнсис Крик предложил только в 1958 году, поэтому развитие иммунологии до этого времени было заторможено незнанием принципа синтеза белковой молекулы. Считалось, что белки синтезируются на белковой матрице (что, конечно, оказалось совсем не так), и что уникальность матрицы определяет уникальность первичной структуры синтезируемого белка. Сходным образом должен был происходить и синтез антител, в процессе которого в качестве матрицы выступал антиген: антитела синтезировались прямо на его поверхности - аминокислоты сшивались в цепочку, комплементарную конформации антигена. Подобные представления о происхождении специфичности антител носили название матричных теорий .

Позднее получили данные, свидетельствующие в пользу того, что антитела имеют довольно схожую белковую природу. Компромисс был достигнут в теории Лайнуса Полинга и Дэна Кемпбелла. Они полагали, что до встречи с антигеном в организме синтезируются «протоантитела» в виде коротких белковых цепочек. После контакта с антигеном эти цепочки приобретают специфичность и далее сшиваются с помощью дисульфидных связей в двухвалентное антитело.

Конец: клонально-селекционная теория

Матричные теории ничего не говорили о продукции антител. Тем временем науке стали известны некоторые фенóмены, которые трудно объяснялись матричными теориями, такие как иммунологическая память (способность при повторном контакте с антигеном отвечать более быстрым, сильным и специфичным образованием антител) и иммунологическая толерантность (способности не реагировать на собственные антигены). Все эти феномены предполагали наличие более тонкого механизма, чем логичные и механистические матричные теории.

В 1948 году шведская исследовательница Астрид Фагреус показала, что источником антител являются активированные В-лимфоциты - плазматические клетки , а спустя год, в 1949 году, австралийский вирусолог Фрэнк Бёрнет (рис. 5) совместно с Фрэнком Феннером издал монографию «Продукция антител», где впервые выдвинул гипотезу непрямой матрицы . Согласно ей, антигены способны изменять структуру РНК (наиболее вероятную матрицу для синтеза белка) в антиген-продуцирующих клетках, что приводит к синтезу специфических антител. В теории было немало «белых пятен» - например, оставался абсолютно неясен механизм изменения структуры РНК.

Рисунок 7. Общая схема получения гибридомы. Из селезенки иммунизированной мыши выделяют антитело-продуцирующие клетки, которые сливают с клетками миеломы. В результате слияния образуются гибридомы, которые культивируют в специальной среде для селекции клеток гибридом, продуцирующих антитела.

Технологию производства гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, разработали Сезар Мильштейн и Жорж Келер (рис. 8) в 1970-х годах. О том, как это происходит, можно прочитать в статье Гарри Израилевича Абелева «Моноклональные антитела» .

Технология получения гибридом не была запатентована, и метод беспрепятственно и быстро распространился по многим лабораториям мира, катализировав развитие иммунологической отрасли. Метод гибридом положил начало целому семейству иммунологических технологий, о которых мы рассказывали в статье «Иммунологические технологии » спецпроекта « » . К слову, это был не просто отказ от патентования, а оплошность, причем с довольно громкими, в том числе и политическими, последствиями.

В то время в Великобритании поиском потенциальных биомедицинских продуктов для патентования занималась организация Medical Research Council (MRC ), при этом не имеющая права патентовать сама; патентованием заведовала другая организация - National Research Development Corporation (NRDC ).

В июле 1975 года Тони Викерс, агент MRC, приметил крайне заманчивую для коммерциализации технологию Мильштейна и попросил последнего отправить ему неопубликованный вариант статьи с описанием метода, в это время ожидавшей рецензии в журнале Nature . Викерс немедленно передал заявку в NRDC с вопросом о возможности получения патента, однако организация ничего не ответила. В августе 1975 г. в Nature вышла статья Мильштейна и Келера , и лишь в октябре 1976 года NRDC удостоила авторов ответом, в котором говорилось, что методика получения гибридом не может быть запатентована, так как была ранее опубликована в научном журнале.

Неспособность NRDC запатентовать технику Келера и Мильштейна стала предметом крупных споров в конце 1970-х годов. Подлила масла в огонь непростая экономико-политическая обстановка в Великобритании. Одним из самых яростных критиков отказа патентной организации стала Маргарет Тэтчер , химик по образованию, избранная премьер-министром в 1979 году. Гнев «железной леди» был многократно усилен известием о патентовании Хилари Копровски (главы американской компании «Вистар»), Карло Кроче и Вальтером Герхардом моноклональных антител против опухолевых антигенов, а позднее - антител против антигенов вируса гриппа. Это были первые патенты на технологию получения моноклональных антител. Не радовал английское правительство и тот факт, что в патентах компании «Вистар» моноклональные антитела были созданы с использованием линии клеток миеломы X63, которую в сентябре 1976 года Хилари Копровски предоставил сам Мильштейн.

Предоставление линии клеток соответствовало традиции многих ученых того времени. Немногочисленные требования к адресатам заключались лишь в том, чтобы они указывали в публикациях источник культур, спрашивали разрешение в том случае, если собирались передавать культуру третьим лицам, и отказывались патентовать какие-либо продукты, получаемые из культур этих клеток. И, как показала практика, в особенности последнее требование оказалось трудно выполнимо потому, что не было оформлено юридически.

Так или иначе, Мильштейн не испытывал горьких разочарований и однажды сказал докучавшему его журналисту: «Нет, я не был несчастен, Маргарет Тэтчер - была» . Как и многие ученые того времени, Мильштейн рассматривал патентование со здоровой долей брезгливости и считал, что исполнил свой долг, отправив неопубликованную статью Викерсу в июле 1975 года. Позднее Мильштейн признался, что отсутствие патента было благословением, которое помогло ему плодотворно и свободно трудиться и делиться своими научными результатами. Как настоящий ученый, Мильштейн предпочитал не думать о том, что наличие патента сделало бы его миллионером. А в 1984 году труды Келера и Мильштейна отметили Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом » .

Глава 3. Антитела на страже здоровья: применение в лабораторной и медицинской диагностике

Более века врачи и ученые работали над тем, чтобы сделать из антител «магическую пулю» - высокочувствительный, точный и эффективный препарат для лечения пациентов. Осуществлению этой мечты способствовало открытие и получение моноклональных антител, которые точечно взаимодействуют с заданным антигеном. Некоторые препараты на основе моноклональных антител смогли стать настоящим золотым стандартом лечения.

Однако лечение - не единственное, для чего моноклональные антитела могут использоваться на практике. Сегодня существует множество биодиагностических методов, использующих в качестве инструмента моноклональные антитела.

Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитометрия - важная методика, которая позволяет получать комплексную информацию о множестве клеток за раз. С помощью этого метода можно узнать размер клетки, содержание ДНК или РНК и многие другие параметры. И если в прошлом проточные цитометры себе могли позволить только крупные академические центры, то сейчас такое оборудование есть уже во многих больницах общего профиля. Современные проточные цитометры стали намного меньше, дешевле и удобнее в использовании. «Биомолекула» подробно рассказывала об этой технологии в статье «Проточная цитофлуориметрия » спецпроекта «12 биологических методов в картинках » .

Немного объясним суть методики. Суспензия клеток предварительно метится моноклональными антителами, сшитыми со светящейся меткой, и помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку. Исследуемые клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке пересекают пучок световых (обычно лазерных) лучей, служащих для анализа каждой отдельно взятой клетки. Исходящий свет фокусируют при помощи оптической системы, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы преобразуют в электрические импульсы и анализируют при помощи специального программного обеспечения. Таким образом, результат цитометрического анализа - определение состояния каждой клетки в образце с возможностью разделить образец на популяции клеток.

Спектр применения данной методики необычайно широк: ее используют в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии, сельском хозяйстве. В 1990-х годах, благодаря этому методу, осуществили сортировку индивидуальных хромосом, тетраном (гибридных гибридом, которые производят бифункциональные антитела) и др. Огромный толчок развитию проточной цитометрии дало открытие гибридомной технологии и, как следствие, получение моноклональных антител к большому количеству антигенов как на поверхности клеток, так и в цитоплазме. Большинство клинических применений проточной цитометрии осуществляется именно с помощью моноклональных антител. Так, получены коммерчески доступные антитела, которые позволяют определять поверхностные антигены лейкоцитов человека. Такие моноклональные антитела применяют для определения опухолей, лейкемий, диагностирования различных аутоиммунных заболеваний, исследования активации клеток иммунной системы: лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов и др. .

Также важным шагом для изучения клеток стало получение моноклональных антител к различным фосфоэпитопам, поскольку информация о фосфорилировании белка нередко позволяет установить его функцию. Впервые фосфорилин-зависимые поликлональные антитела получили в 1981 году. Сейчас же наличие аналогичных, но моноклональных антител обеспечивает более эффективное изучение функционирования клеток. Также сейчас коммерчески доступны антитела, меченные различными флуоресцентными белками. Это позволяет исследователю использовать их таким образом, чтобы на меньшем объёме образцов получать о них максимальную информацию.

Иммуногистохимия

Еще одним важным диагностическим методом, в котором используются моноклональные антитела, является иммуногистохимия. На всех тканях, в том числе и опухолевых, содержатся молекулы, служащие мáркерами той или иной ткани или популяции клеток. Окрашивание среза ткани моноклональными антителами позволяет определить тип опухоли и подобрать необходимое лечение. Так же, как и в случае проточной цитометрии, метод гибридом позволил исследователям получить моноклональные антитела к различным тканевым и опухолеассоциированным антигенам, что способствовало широкому распространению метода иммуногистохимии. В XX веке иммуногистохимический анализ стали применять в диагностике онкологических заболеваний. Сегодня такой анализ зачастую является обязательным для подтверждения первичного диагноза, особенно если лечение требует использования дорогостоящих лекарств. И хотя иммуногистохимия существует около 50 лет, до сих пор данную процедуру довольно сложно стандартизировать. Поэтому крайне важным в этой методике является использование моноклональных антител, которые обладают низкой вероятностью перекрестного взаимодействия с другими белками и возникновения неспецифических сигналов.

Глава 4. Фармацевтическая «аллея славы»: как антитела заняли лидирующие позиции на рынке лекарственных препаратов

В 1985 году, спустя всего лишь год после вручения Келеру и Мильштейну Нобелевской премии за разработку методики получения моноклональных антител, FDA одобрило самое первое лекарство на основе мышиного моноклонального антитела - муромонаб , или OKT3 . Свое название оно получило от сокращения его изначального длинного названия - MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3 , что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3». Антитело взаимодействовало с особой молекулой CD3 на поверхности T-лимфоцитов, которая важна в том числе и для развития реакции отторжения трансплантированного органа (например, почки). Соответственно, блокируя CD3, можно добиться лучшего приживания органа в организме реципиента. Однако впоследствие у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, которые были вызваны ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом . Поэтому следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного материала в препарате.

Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных или гуманизированных антителах. В химерных антителах участки, которые непосредственно распознают антиген, имеют мышиное происхождение, а остальная (и бóльшая) часть антитела - человеческое. А в гуманизированных антителах доля мышиного материала еще меньше, и поэтому они еще реже вызывают негативные реакции со стороны организма пациента.

Помимо моноклональных, существуют также и другие типы антител . Рассмотрим их поподробнее.

Лидирующие позиции на рынке пока остаются за классическими моноклональными антителами . По данным 2014 года, из 47 препаратов на основе моноклональных антител, одобренных и продаваемых на тот момент в США и Европе, 31 является полноразмерным моноклональным антителом . Один препарат - это биспецифическое антитело, три - конъюгированные антитела, три - Fab-антитела и девять - Fc-слитые белки (табл. 1). Скорее всего, связано это с тем, что оптимизировать получение и функционирование генетически инженерных конструктов довольно сложно, хотя с каждым годом количество таких препаратов продолжает увеличиваться.

В последние годы темпы развития рынка моноклональных антител непрерывно растут. В 2015 году глобальный доход от продаж таких препаратов составил чуть менее $90 млрд - это почти 60% от общего объема продаж всех биофармацевтических продуктов. При этом шесть из десяти самых продаваемых биофармацевтических продуктов в 2015 году оказались моноклональными антителами .

Известно, что по состоянию на 31 октября 2016 года на рынках США и Европы существует уже 71 препарат на основе моноклональных антител . Также в 2010 году одобрили 10 новых препаратов для использования на территориях США и Европы. По состоянию на 1 декабря 2017 года девять терапевтических моноклональных антител проходят регуляционные тестирования, и сведения об их использовании станут известны в конце 2018 года. Также в конце 2018 года представят заявки на получение торговой лицензии еще 12 новых препаратов, из которых четыре предназначаются для лечения онкологических заболеваний.

Humira , Remicade , Enbrel , Rituxan , Avastin и Herceptin являются шестью самыми продаваемыми препаратами на основе моноклональных антител (рис. 9). Расскажем поподробнее про каждый из них.

Рисунок 9. Динамика продаж коммерческих препаратов моноклональных антител. Сравнение уровня продаж препаратов шести моноклональных антител по сравнению с препаратами рекомбинантных белков Avonex и Rebif в период с 2006 по 2015 год. В 2016 году доход от продажи каждого из шести препаратов превышал $6,5 млрд.

«Хумира» (адалимумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой фактора некроза опухолей (TNF) и таким образом уменьшает воспаление. Препарат используют для лечения ревматоидного артрита , псориаза , болезни Крона и других аутоиммунных заболеваний. В 2015 году объемы продаж этого препарата составили $14 млрд, что сделало его самым продаваемым лекарством. «Ремикейд» (инфликсимаб) и «Энбрель» (этанерцепт ) - также препараты на основе антител, связывающихся с молекулой TNFα. Ввиду того, что эти препараты вышли на рынок несколько позже Humira, их объемы продаж несколько меньше: около $8 млрд каждого. «Ритуксан» (ритуксимаб) - антитело, связывающееся с белком CD20, который экспрессируется только на поверхности В-клеток. Кроме того, более 90% В-клеточных неходжкинских лимфом также экспрессируют CD20. Препарат буквально убивает бóльшую часть В-лимфоцитов. Казалось бы, это чрезвычайно вредно для организма, ведь В-лимфоциты - важные игроки иммунной защиты. Однако не стоит забывать, что бóльшая часть В-клеток в крови пациентов - это опухолевые клетки. Избавляясь от них, мы даем организму шанс начать производить новые здоровые клетки, и уже через 12 месяцев уровень В-лимфоцитов полностью восстанавливается.

Классические методы лечения неходжкинской лимфомы, такие как химиотерапия и радиационная терапия, обладают высокой токсичностью, а также низкопецифичны в отношении опухоли, так как уничтожают большое количество здоровых клеток. Тогда как терапия антителами более избирательна и менее разрушительна для организма . Получение ритуксимаба, менее агрессивного и более щадящего препарата, стало важной вехой развития медицины и позволило вывести лечение онкологических пациентов на качественно новый уровень. Именно поэтому в 1997 году ритуксимаб одобрили для лечения B-клеточной неходжкинской лимфомы, а в 2010 - в качестве поддерживающей терапии после первичного лечения фолликулярной лимфомы. Ритуксимаб находится в перечне основных лекарственных средств ВОЗ, в списке наиболее важных лекарств, необходимых в базовой системе здравоохранения. Для некоторых заболеваний (таких как гранулематоз с полиангитом и микроскопический полиангит) лечение ритуксимабом является единственным одобренным FDA. Ритуксимаб также активно используется в лечении ревматоидного артрита в комбинации с метотрексатом, что у половины пациентов приводит к улучшению симптомов в течение полугода. Если же пациенты принимают только метотрексат, то улучшение наблюдается лишь у 18%. «Авастин» (бевацизумаб) - моноклональное антитело, блокирующее работу эндотелиального фактора роста A (VEGF-A). В 1989 году Наполеон Феррара, молекулярный биолог, работавший в лаборатории корпорации Genentech, обнаружил молекулу VEGF (Vascular endothelial growth factor ) - белок, который способствует росту сети кровеносных сосудов (ангиогенезу ). В 1993 году Феррара показал, что блокирование работы VEGF специфическими моноклональными антителами приводит к резкому замедлению роста различных опухолей. Его исследования подтверждали ранее предложенную гипотезу Иуды Фолькмана, в которой говорилось, что остановка ангиогенеза может быть эффективным путем борьбы с опухолями, поскольку они начинают получать меньше питательных веществ и погибают. Стало понятно, что необходимо получить препарат, который будет блокировать молекулу VEGF. Это привело бы к ингибированию разрастания сети кровеносных сосудов вокруг опухоли, и та, не получая достаточного кровоснабжения, перестанет расти и метастазировать.

И вот, интенсивная работа исследователей принесла свои плоды - было получено несколько моноклональных антител, распознающих фактор VEGF-A. Каждое из этих антител связывалось с различными участками, или, говоря научным языком, эпитопами, молекулы VEGF-A , . Но лишь одно антитело оказалось способным распознавать и нейтрализовывать все изоформы этой молекулы. На его основе и был разработан препарат бевацизумаб - первый клинически используемый ингибитор роста кровеносных сосудов. Важность и революционность данного препарата заключается в том, что до его получения не существовало лекарств, нацеленных на прямую борьбу с ангиогенезом. В 1997 году начали проводить первые клинические испытания «Авастина» (торговое название бевацизумаба), а в 2004 году в США было получено одобрение для использования этого препарата в комбинированной терапии по лечению метастатического рака толстой кишки.

Позже «Авастин» стали использовать для лечения и других опухолей. Добавление его к стандартной химиотерапии 5-фторурацилом увеличивает продолжительность жизни пациентов. Также применение «Авастина» совместно с 5-фторурацилом существенно удлиняет промежуток времени, в течение которого опухоль увеличивается до первоначальных размеров. И, самое главное, «Авастин» совместно со стандартной химиотерапией уменьшает размеры самой опухоли: 45% против 35%. «Герцептин» (трастузумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой Her2/neu и блокирует ее. Если Her2/neu присутствует на клетках в избыточном количестве, это зачастую приводит к развитию рака молочной железы.

Возникает закономерный вопрос - почему рынок моноклональных антител столь популярен и быстро развивается? Дело в том, что сейчас антитела - одни из самых удобных и эффективных инструментов для решения различных биомедицинских проблем. Антитела, как правило, хорошо переносятся организмом человека и обладают высокой специфичностью к антигену, что снижает риск неожиданных осложнений в клинических испытаниях. Зачастую для многих фармацевтических задач моноклональные антитела являются первыми кандидатами на получение продукта, который можно относительно быстро проверить в клинических испытаниях. Если предварительные исследования клинической эффективности успешны, то такой инновационный препарат можно быстро коммерциализировать и вывести на рынок.

Также в целом происходит глобальный рост фармацевтического рынка, глобальный рост населения, а в странах с развитой экономикой наблюдается повышение уровня жизни - все эти факторы обеспечивают повышенный спрос на новые биопрепараты. В современных условиях существует запрос на получение большого количества относительно недорогих в производстве противоревматоидных и противоастматических средств, и с этой задачей как нельзя лучше могут справиться моноклональные антитела. С каждым годом биофармацевтическая промышленность растет и развивается, при этом появляется всё больше возможностей для облегчения и корректировки течения многих заболеваний, в том числе при помощи моноклональных антител.

В России самой успешной компанией, занимающейся производством и выпуском препаратов на основе моноклональных антител, является . Уже сейчас компания выпускает около 20 лекарственных препаратов , предназначенных для лечения различных злокачественных опухолей, среди которых есть аналоги трастузумаба и бевацизумаба. Более 40 препаратов находится на стадии разработки, два из них планируют зарегистрировать в 2018 году (один из препаратов будет биоаналогом самого продаваемого aдалимумаба). BIOCAD первой из российских компаний стал лидером продаж препаратов, предназначенных для терапии онкологических заболеваний. По данным аудита фармацевтического рынка России, проводимого аналитической компанией IMS Health за январь–декабрь 2017 года, биотехнологическая компания BIOCAD второй год подряд удерживает лидерство в сегменте бюджетных закупок в рублях в конечных ценах (учитывались сведения по всем препаратам), а также впервые возглавила рейтинг поставщиков в сегменте государственных закупок противоопухолевых препаратов как в рамках программы 7ВЗН, так и вне ее.

7ВЗН - это программа «Семь высокозатратных нозологий», которая обеспечивает лекарствами людей с редкими заболеваниям. Доля BIOCAD в госзакупках лекарственных средств в 2017 году составила 4,2% при выручке 15,66 млрд рублей. В тройку лидеров вошли также NOVARTIS и Sanofi-Aventis с показателями 3,5% и 3,2%, соответственно. Список замыкает АО «Генериум» , вторая российская компания, попавшая в топ-10 фармацевтических компаний, поставщиков лекарственных средств в государственные лечебные учреждения. В сегменте противоопухолевых препаратов BIOCAD удерживает 14,2% без учета 7ВЗН и 18,9% с учетом программы.

Итак, теперь мы знаем, что моноклональные антитела - это настоящая «магия» во флаконе. Без них было бы сложно, а иногда и невозможно, вылечить или улучшить течение множества заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных. Прошло примерно 50 лет с момента разработки технологии гибридом, и за это время было получено большое количество жизненно важных препаратов. Огромный спрос на моноклональные антитела показывает, насколько востребованными и эффективными являются эти лекарства. В последующих статьях цикла будет рассказано, как биотехнологи «улучшают» работу моноклональных антител, какие из современных препаратов созданы на их основе и как работает BIOCAD - успешная отечественная компания по разработке и производству моноклональных антител.

Таблица 1. Препараты на основе моноклональных антител, доступные в продаже (2014 год)

Название, торговая марка и год регистрации	Вид антитела	Компания / выпускающие компании в США и Европе	Глобальные продажи на 2013 год («–» - продукт зарегистрирован в конце 2013–2014 годах), млн $	Мишень	Показания
Раксибакумаб («Абтракс»), 2012	Моноклональное	Human Genome Sciences / Glaxo Smith Kline (США)	23	Токсины B. anthracis	Ингаляционная форма сибирской язвы
Тоцилизумаб («Актемра»), 2009	Моноклональное	Roche / та же (США, Европа)	1,119	IL-6R
Брентуксимаб ведотин («Адцетрис»), 2011	Конъгированное	Seattle Genetics / та же (США)/Takeda Pharmaceutical Co.(Европа)	253	CD30	Лимфома Ходжкина, анапластическая крупноклеточная лимфома
Фактор IX Fc-слитый белок, («Алпроликс»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec. / та же (США)	–	Фактор IX	Гемофилия типа B
Рилонацепт («Аркалист»), 2008	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США)	17	Fc-IL1R	Семейный холодовой аутовоспалительный синдром, синдром Макла-Уэльса
Офатумумаб , («Арзерра»), 2009	Моноклональное	GlaxoSmithKline / та же (США, Европа)	117	CD20	Хронический лимфоцитарный лейкоз
Бевацизумаб , («Авастин»), 2004	Моноклональное		6,748	VEGF	Метастатический колоректальный рак, рак молочной железы, неплоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого, почечно-клеточный рак, глиобластома, эпителиальный рак яичника, маточной трубы и первичный рак брюшины
Белимумаб , («Бенлиста»), 2011	Моноклональное	Human Genome Sciences / GlaxoSmithKline (США, Европа)	228	BLyS	Системная красная волчанка
Цертолизумаб пэгол («Симзия»), 2008	Fab-конъюгат	UCB / та же (США, Европа)	789	TNFα	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, аксиальный спондилоартрит, псориатическая и энтеропатическая артропатия
Рамуцирумаб («Сирамза»), 2014	Моноклональное	Eli Lilly and Co. / та же (США)	–	VEGFR2	Рак желудка, немелкоклеточный рак легких, колоректальный рак
Фактор VIII Fc-слитый белок («Элоктат»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec / та же (США)	–	Фактор VIII	Гемофилия типа A
Этанерцепт («Энбрел»), 1998	Fc-слитый белок	Immunex / Amgen (США) и Pfizer (Европа)	8,325	TNFα	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, аксиальная форма спондилоартрита, псориаз
Ведолизумаб («Энтивио»), 2014	Моноклональное	Takeda Pharmaceutical Co. / та же (США, Европа)	–	α4β7-интегрин	Язвенный колит, болезнь Крона
Цетуксимаб («Эрбитукс»), 2004	Моноклональное	ImClone Systems / Bristol-Myers Squibb (США) и Merck KGaA (Европа)	1,926	EGFR	Метастатический колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи
Афлиберцеп т («Эйлеа»), 2011	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США) и Bayer Healthcare Pharmaceuticals (Европа)	1,851	VEGF-A	Окклюзии сосудов сетчатки, дегенерация макулы, диабетическая ретинопатия
Обинутузумаб («Газива»), 2013	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	3	CD20	Хронический лимфолейкоз, фолликулярная лимфома
Трастузумаб («Герцептин»), 1998	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	6,559	Her2/neu	Рак молочной железы
Адалимумаб («Хумира»), 2002	Моноклональное	Abbott Laboratories / AbbVie (США, Европа)	10,659	TNFα	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, активный анкилозирующий спондилит, псориаз, язвенный колит, болезнь Крона, гнойный гидраденит
Канакинумаб («Иларис»), 2009	Моноклональное		119	IL-1β	Острый подагрический артрит, cемейный холодовой аутовоспалительный синдром, cиндром Макла-Уэльса, младенческое мультисистемное воспалительное заболевание
Инфликсимаб («Инфлектра»), 2013	Моноклональное	Hospira / та же (Европа)	<1	TNFα	Ревматоидный артрит, псориатический артрит, болезнь Крона
Трастузумаб эмтанзин («Кадсила»), 2013	Конъюгированное	Genentech / Roche (США, Европа)	252	HER2	Метастатический рак молочной железы
Пембролизумаб («Kитруда»), 2014	Моноклональное	Merck & Co. / та же (США)	–	PD-1	Неопераблельная метастатическая меланома, немелкоклеточный рак легких
Алемтузумаб («Лемтрада»), 2013	Моноклональное	Genzyme Therapeutics / Sanofi (Европа)	3	CD52	Хронический лимфолейкоз
Ранибизумаб («Луцентис»), 2006	Fab-фрагмент антитела	Genentech / Roche (США) и Novartis Pharmaceuticals (Европа)	4,205	VEGF	Неоваскулярная форма возрастной макулярной дегенерации, диабетический отек макулы, патологическая миопия, диабетическая ретинопатия
Ромиплостим («Энплейт»), 2008	Fc-слитый белок	Amgen / та же (США, Европа)	427	Рецептор тромбопоэтина cMpl	Хроническая идиопатическая (иммунная) тромбоцитопеническая пурпура
Белатацепт («Нулоджикс»), 2011	Fc-слитый белок		26	CD80 и CD86
Абатацепт («Оренсия»), 2005	Fc-слитый белок	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	1,444	CTLA4	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит
Пертузумаб («Перьета»), 2012	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	352	HER2	Метастатический или местно-рецидивирующий неоперабельный рак молочной железы
Деносумаб («Пролиа»), 2011	Моноклональное	Amgen / та же (США) и GlaxoSmithKline (Европа)	824	RANKL	Постменопаузный остеопороз, потеря костной массы у женщин, получающих терапию ингибиторами ароматазы по поводу рака молочной железы, и у мужчин с раком предстательной железы, получающих гормон-депривационную терапию
Инфликсимаб («Ремикейд»), 1998	Моноклональное	Centoco / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co. (Европа)	8,944	TNFα
Катумаксомаб («Ремоваб»), 2009	Биспецифическое	Fresenius Biotech / NeoPharm Group (Европа)	5	EpCAM и CD3	Карциноматозный асцит
Инфликсимаб («Ремисима»), 2013	Моноклональное	Celltrion / та же (Европа)	<1	TNFα	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, псориаз
Абциксимаб («РеоПро»), 1994	Fab-фрагмент антитела	Centocor / Lilly (США)	127	Гликопротеиновый рецептор типа IIb/IIIa тромбоцитов	Профилактика ишемии миокарда у больных группы повышенного риска, которым планируется проведение чрескожной коронарной баллонной ангиопластики, имплантация стента или атерэктомия
Ритуксимаб («Ритуксан»), 1997	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	7,500	CD20	B-клеточные неходжкинские лимфомы
Голимумаб («Симпони»), 2009	Моноклональное	Centocor Ortho Biotech / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co (Европа)	1,432	TNFα	Ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит
Базиликсимаб («Симулект»), 1998	Моноклональное	Novartis Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	30	CD25	Профилактика отторжения трансплантата после пересадки почки
Экулизумаб («Солирис»), 2007	Моноклональное	Alexion Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	1,551	C5-компонент комплемента	Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
Устекинумаб («Стелара»), 2009	Моноклональное	Janssen-Cilag International / Johnson & Johnson (США, Европа)	1,504	IL12 и IL23	Бляшечный псориаз, псориатический артрит
Силтуксимаб («Силвант»), 2014	Моноклональное	Janssen Biotech / Johnson & Johnson (США, Европа)	–	IL-6	Болезнь Кастлемена
Паливизумаб («Синагис»), 1998	Моноклональное	Abbott Laboratories / AstraZeneca (США) и Abbvie (Европа)	1,887	Белок F респираторного синцитиального вируса	Профилактика тяжелой инфекции нижних дыхательных путей, вызванной респираторным синцитиальным вирусом
Натализумаб («Тизабри»), 2004	Моноклональное	Biogen Idec / та же (США, Европа)	1,527	Интегрин	Рассеянный склероз
Панитумумаб («Вектибикс»), 2006	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	389	EGF	Метастатический колоректальный рак
Деносумаб («Иксгева»), 2010	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	1,030	RANKL	Профилактика симптомов, связанных с патологией костной ткани у взрослых пациентов с метастазами солидных опухолей в костную ткань.
Омализумаб («Ксолар»), 2003	Моноклональное	Genentech / Roche (США) и Novartis (Европа)	1,465	FcεRI-рецептор	Атопическая бронхиальная астма, хроническая идиопатическаяй крапивница
Ипилимумаб («Ервой»), 2011	Моноклональное	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	960	CTLA-4	Неоперабельная или метастатическая меланома
Афлиберцепт («Залтрап»), 2012	Fc-слитый белок	Sanofi Aventis / Sanofi (США, Европа)	70	VEGF	Метастатический колоректальный рак, возрастная влажная макулярная дегенерация
Ибритумомаб («Зевалин»), 2002	Конъюгированное	IDEC Pharmaceuticals / Spectrum Pharmaceuticals (США, Европа)	29	CD20	В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома

Департамент вычислительной биологии компании BIOCAD - спонсор спецпроекта

Одна из крупных международных биотехнологических компаний в России, объединившая научно-исследовательские центры мирового уровня, современное фармацевтическое и биотехнологическое производство, проведение доклинических и клинических исследований препаратов, соответствующих международным стандартам. В компании реализован полный цикл выпуска лекарственных препаратов: от поиска лекарственной молекулы до массового производства и маркетинговой поддержки. Разрабатываемые препараты применяют в лечении таких сложных заболеваний как рак, рассеянный склероз, ВИЧ и т.д.

В компании верят в предиктивную силу биологии и считают математическое моделирование основой для развития биотехнологий сегодня. То, что раньше было возможно осуществить исключительно in vitro в стенах лабораторий, сегодня может быть воплощено in silico силой чистого разума. Здесь собрали одну из лучших команд биоинформатиков в стране, которая занимается научными исследованиями, разрабатывает и внедряет новейшие методы интеллектуального анализа данных. В ее распоряжении один из мощнейших вычислительных кластеров, и если еще 2–3 года назад можно было только мечтать о решении задач направленного дизайна белковых молекул, то сейчас это одно из направлений работ Департамента вычислительной биологии.

Нам кажется, что в рамках совместного с «Биомолекулой» спецпроекта читателям будет интересно познакомиться с нюансами гуманизации антител и процессом поиска мишеней под конкретную нозологию.

Вполне возможно, вы уже знаете, что на основании ретроспективного анализа большинства известных моноклональных препаратов наша компания сформулировала современные требования к непатентуемым коммерческим наименованиям, которые были рассмотрены и приняты на заседании ВОЗ.

Раскрывая эту тему, постараемся описать различные виды антител и их уникальных vhh-представителей, коснуться вопроса иммуногенности и уже через него выйти к теме необходимости/желательности гуманизации. А также рассказать о пространственной структуре антител и о том, какие сложности с сохранением структуры поджидают исследователей при внесении мутаций.

Материал предоставлен партнёром - Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD

Литература

1. Первый «медицинский нобель» ;
2. Zielinska E. (2013). Side-chain theory, circa 1900 ;. . ;
3. Dotan E., Aggarwal C., Smith M.R. (2010). Impact of Rituximab (Rituxan) on the treatment of B-cell non-Hodgkin"s lymphoma . P. T. 35 , 148–157;
4. Domenico Ribatti. (2011). From the discovery of Vascular Endothelial Growth Factor to the introduction of Avastin in clinical trials - an interview with Napoleone Ferrara . Int. J. Dev. Biol. . 55 , 383-388.