Кафедра товароведения и товарной экспертизы лабораторный практикум по дисциплине «безопасность товаров. Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения
Методы определения микотоксинов. Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.
Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный метод определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; методы тонкослойной хроматографии (ТСХ-методы) для одновременного определения до 30 различных микотоксинов, флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами, и некоторые другие.
Количественные аналитические методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. Химические методы являются в настоящее время наиболее распространенными и состоят из двух стадий: стадии выделения и стадии количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов, таких как газовая (ГХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия. Количественную оценку содержания микотоксинов проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции при ТСХ в ультрафиолетовой области спектра со стандартами. Для подтверждения достоверности полученных результатов применяют различные тесты, основанные на получении производных микотоксинов с иными хроматографическими, колориметрическими или флюорометрическими характеристиками.
Высокочувствительные и высокоспецифичные радиоиммуно-химические и иммуноферментные методы обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов находят все более широкое применение и пользуются повышенным вниманием со стороны исследователей. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Основным преимуществом этих методов является их исключительная чувствительность.
Биологические методы обычно не отличаются высокой специфичностью и чувствительностью и применяются, главным образом, в тех
случаях, когда отсутствуют химические методы выявления микотоксинов или в дополнение к ним в качестве подтверждающих тестов. В качестве тест-объектов используют различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, различные лабораторные животные, культуры клеток и тканей.
Контроль за загрязнением микотоксинами. В настоящее время вопросы контроля за загрязнением продовольственного сырья, пищевых продуктов и кормов микотоксинами решаются не только в рамках отдельных государств, но и на международном уровне, под эгидой ВОЗ и ФАО.
В системе организации контроля за загрязнением продовольственного сырья и пищевых продуктов можно выделить два уровня: инспектирование и мониторинг, которые включают регулярные количественные анализы продовольственного сырья и пищевых продуктов.
Мониторинг позволяет установить уровень загрязнения, оценить степень реальной нагрузки и опасности, выявить пищевые продукты, являющиеся наиболее благоприятным субстратом для микроскопических грибов - продуцентов микотоксинов, а также подтвердить эффективность проводимых мероприятий по снижению загрязнения микотоксинами. Особое значение имеет контроль за загрязнением микотоксинами при характеристике качества сырья и продуктов, импортируемых из других стран.
С целью профилактики алиментарных токсикозов основное внимание следует уделять зерновым культурам. В связи с этим необходимо соблюдать следующие меры по предупреждению загрязнения зерновых культур и зернопродуктов.
1. Своевременная уборка урожая с полей, его правильная агротехническая обработка и хранение.
2. Санитарно-гигиеническая обработка помещений и емкостей для хранения.
3. Закладка на хранение только кондиционного сырья.
4. Определение степени загрязнения сырья и готовых продуктов.
5. Выбор способа технологической обработки в зависимости от вида и степени загрязнения сырья.
Основные пути загрязнения продовольственного сырья и пищевых продуктов токсичными штаммами микромицетов приведены на рис. 11.7.
536:: 537:: Содержание
537:: 538:: 539:: 540:: 541:: 542:: 543:: 544:: 545:: 546:: 547:: 548:: 549:: 550:: Содержание
Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Отбирают полученные экстракты в микрофлаконы, производят выпаривание растворителя и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана. В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Продолжительность определения микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к пищевой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано при определении содержания микотоксинов в пищевых продуктах, зерновых культурах, комбикормах и мясе с целью оценки их безопасности.
Методик определения всех нормируемых микотоксинов из одной навески в настоящее время не предложено. Известны способы определения отдельных микотоксинов или отдельных классов.
Так, для определения зеараленона, Т-2, охратоксина А применяют тонкослойную хроматографию для каждого токсина отдельно (ГОСТ 28001-88. Методы определения микотоксинов Т-2, зеараленона и охратоксина А. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма). Метод чрезвычайно сложный, длительный и позволяет полуколичественно определить указанные микотоксины каждого из отдельной навески.
Известен способ определения афлатоксинов (B1, B2, G1, G2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ГОСТ Р 53162-2008. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1, G2). Афлатоксины экстрагируют метанолом, экстракт очищают и концентрируют на иммуноаффинной колонке, элюируют метанолом, упаривают до малого объема и хроматографируют. Методика длительна, дорогостояща и требует применения большого количества растворителей.
Известен способ определения дезоксиниваленола (ГОСТ Р 51116-97. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола), основанный на извлечении микотоксина из пробы ацетонитрилом, очистке экстракта на двух последовательных колонках с углем, элюировании дезоксиниваленола ацетонитрилом, упаривании экстракта до малого объема и анализ методом жидкостной хроматографии с УФ-детектором. Однако предлагаемый способ длителен, трудоемок и не позволяют одновременно определить все микотоксины.
Известен способ определения патулина (Патент РФ № 2056044, G01N 33/02. Способ количественного определения патулина в пищевых продуктах), основанный на извлечении патулина из пробы этилацетатом, очистке экстракта на адсорбенте, концентрировании экстракта и анализе методом жидкостной хроматографии. Методика длительна и требует применения большого количества растворителей.
Известен способ одновременного определения трихотоценовых микотоксинов и зеараленона в зерне методом газовой хромато-масс-спектрометрии (Toshitsuga Tanaka at al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry / J.Chromatogr. A. 2000. 882. P.23-28). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 10 г навески 100 мл ацетонитрила в течение 30 мин, удалении жира экстракцией 20 мл гексана, упаривании ацетонитрильного экстракта досуха, растворении сухого остатка в смеси метанола с хлороформом, очистки экстракта на колонке с флорисилом, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в 2 мл метанола, дериватизации тетраметилсиланом и затем хроматографировании. Способ длителен, трудоемок и дорогостоящ.
Известен способ одновременного определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона в зерне методом высокоэффективной хроматографии с флуориметрическим детектором (Gobel R., Lusky К. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquit chromatography / Food Chemical Contaminants. 2004. V.87. № 2. P.411-418). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора ацетонитрила, очистки экстракта на иммуноаффинной колонке, извлечении из колонки микотоксинов 2 мл метанола, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в гексане, дериватизации трифторуксусной кислотой 15 мин, упаривании досуха, растворении остатка в метаноле и определении микотоксинов при разных длинах волн (афлатоксины - 360-440 нм, зеараленон - 276-466 нм и охратоксин А - 330-460 нм). Способ длителен и трудоемок, требует большого количества растворителей.
Наиболее близким к предлагаемому является способ одновременного определения афлатоксинов в зерновых продуктах (Campone L., Piccinelli A.L., Cetano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in cereal products / J.Chromatogr. A.2011. 1248. P.7548-7554). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора метанола, удалении жира экстракцией 6 мл гексана, очистки 1 мл экстракта с использованием дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции хлороформом (220 мкл), удалении хлороформа, растворении остатка в 0,1 мл метанола и определении афлатоксинов методом ФЭЖХ с флуориметрическим детектором. Коэффициент концентрирования микотоксинов составляет 2,0-2,5. Однако метод длителен, требует большого количества растворителей, мал коэффициент концентрирования и не дает возможности определения других микотоксинов из этого же экстракта. Продолжительность анализа только для афлатоксинов составляет 1,5-2 часа.
Цель изобретения - сокращение продолжительности анализа, увеличение воспроизводимости и надежности результатов анализа, сокращение расхода органических растворителей и обеспечение безопасности оператора.
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения микотоксинов, включающему отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck F.J. // J. AOAC Int. 2003. V.86. № 2. P.412), центрифугирование и определение хроматографическими методами. В предлагаемом способе экстракцию проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13- и 15-ацетилдезоксиниваленол, патулин, зеараленон, охратоксин А) методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.
Пример определения микотоксинов. В пробирку вместимостью 50 мл помещают 2,000 г измельченного продукта (зерно, комбикорм, мясо), добавляют 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды, энергично встряхивают 5 мин, высыпают смесь солей (4 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 1 г цитрата натрия одноводного и 0,5 г цитрата натрия 1,5-водного), закрывают и энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают 8 мл полученного экстракта в пробирку вместимостью 15 мл, содержащую 0,9 г сульфата магния, по 0,2 г сорбентов Bondesil PSA и С18, энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.
В три пробирки отбирают по 2 мл полученного экстракта. В первую вносят 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, во вторую - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, в третью - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси каждую отдельно впрыскивают с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в конических центрифужных пробирках, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне и центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстрактов в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана.
В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Условия хроматографирования: колонка «Kromasil С18», 150 мм, подвижная фаза ацетонитрил/вода (30/70), объем пробы 10 мкл, длина волны возбуждения 340 нм, детектирования 450 нм для афлатоксинов, 330-460 нм для охратоксина А и 276-460 для зеараленона.
Во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпетол, 13-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдезоксиниваленол), зеараленон, патулин, охратоксин А методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов. Условия хроматографирования: капиллярная колонка «OPTIMA ® - 5 - Accent» (Macherey - Nagel, Германия, 30 м), температура термостата колонки 120°С, температура испарителя 200°С, детектора 300°С. Температура термостата колонки 120-310°С (скорость нагрева 15 град./мин), газ-носитель - азот, объем вводимой пробы 1 мкл без деления потока.
В третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Условия хроматографирования: колонка хроматографическая «XTerra RP18», 150 мм, подвижная фаза - ацетонитрил/вода (градиент 4-80% ацетонитрила), скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, детектирование при аналитических длинах волн 236 и 270 нм.
Основные метрологические характеристики определения микотоксинов в оптимальных условиях по данной методике при введенных добавках стандартов микотоксинов в зерно, мясо и комбикорма на трех уровнях концентраций указаны в таблице.
Продолжительность определения для указанных в таблице микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Коэффициент концентрирования примерно в 3 раза выше по сравнению с прототипом, что приводит к более чувствительному определению указанных микотоксинов. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа.
| Таблица | |||||
| Основные метрологические характеристики определения микотоксинов | |||||
| Время удержи-вания, t R , мин | Диапазон определяемых содержании, мг/кг | Коэффициент концентрирования, К | |||
| Микотоксин | Введено, мг/кг | Степень извлечения, R, % | |||
| В1 | 24,2 | 0,00005-0,001 | 0,00005; 0,0005; 0,001 | 7,8-8,0 | 100-109 |
| В2 | 10,3 | 0,00001-0,001 | 0,00005; 0,0005; 0,001 | 7,2-7,8 | 88-91 |
| G1 | 20,6 | 0,00005-0,001 | 0,00005; 0,0005; 0,001 | 7,8-8,0 | 98-100 |
| G2 | 8,2 | 0,00001-0,001 | 0,00005; 0,0005:0,001 | 7,6-7,8 | 86-98 |
| Т-2 | 19,7 | 0,01-3 | 0,01; 1,0; 2,0 | 6,1-7,3 | 80-90 |
| НТ-2 | 18,1 | 0,003-0,3 | 0,005;0,01;0,1 | 6,4-6,9 | 82-83 |
| ДОН | 14,2 | 0,01-2 | 0,01; 1,0:2,0 | 7,6-8,9 | 98-100 |
| зон | 18,7 | 0,01-2 | 0,01: 1,0; 2,0 | 6,8-7,5 | 87-94 |
| 3-АДОН | 16,5 | 0,01-2 | 0,01:1,0:2,0 | 6,8-7,5 | 89-97 |
| 15-АДОН | 15,7 | 0,01-2 | 0,005:0,01:0,1 | 6,1-7,7 | 87-88 |
| Ниваленол | 14,3 | 0,003-0,3 | 0,005:0,01:0,1 | 6,4-7,5 | 85-97 |
| ДАС | 16,7 | 0,01-2 | 0,01; 1,0:2,0 | 6,0-7,3 | 76-98 |
| ОТА | 11,4 | 0,002-0,2 | 0,005:0,01:0,1 | 6,5-7,7 | 87-96 |
| Патулин | 7,1 | 0,01-2 | 0,01; 1,0: 2,0 | 6,8-7,8 | 89-96 |
| ДОН - дезоксиниваленол, ЗОН - зеараленон, 13, 15-АДОН - ацетилдезоксиниваленол, ДАС - диацетооксискирпенол, ОТА - охратоксин А | |||||
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения, включающий отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS), центрифугирование и определение хроматографическими методами, отличающийся тем, что извлечение микотоксинов проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, зеараленона и охратоксина А) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.
ГОСТ 32835-2014
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ
Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)
Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
МКС 67.080.01
Дата введения 2016-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" (ФГБОУ ВПО "МГУПП")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Армения | Минэкономики Республики Армения |
|
Беларусь | Госстандарт Республики Беларусь |
|
Киргизия | Кыргызстандарт |
|
Россия | Росстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.
5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:
- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары);
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru . - Примечание изготовителя базы данных.
- Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. N 406/2006/ЕС "О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах");
- AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей, за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов - патулина и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0,1 до 100,0 мкг/дм и охратоксина А от 0,1 до 20,0 мкг/дм.
Примечание - Настоящий стандарт рекомендуется применять в целях апробации и накопления дополнительной информации в части его применения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб
ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определения относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 1. Общие положения
ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 2. Методы экстракции и очистки
ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 3. Определение и подтверждение результатов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сокращения
ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-спектрометрия;
ОТА - охратоксин А;
ПАТ - патулин;
ESI
- ионизация распылением в электрическом поле (Electrospray Ionization
);
IARC
- Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний;
LOD
- предел детектирования;
LOQ
- предел количественного определения;
SRM
- идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring
).
4 Сущность метода
Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, перерастворении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда
Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС* с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а.е.м.), с точностью измерения массы не ниже 0,1 а.е.м, ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль ВЭЖХ, состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50°С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм C длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0,1 до 100,0 мкг/дм.
________________
* Дополнительная информация о рекомендуемых ВЭЖХ-МС/МС системах приведена в приложении А.
Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0,1%.
Весы по ГОСТ OIML R 76-1, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг.
Баня ультразвуковая.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000-5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 см.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000-12000 об/мин для пробирок типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200°С.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .
Встряхиватель для перемешивания.
Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20-1000 мм с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2,5%.
Микрофильтр - насадка на шприц (регенерированная целлюлоза, диаметр 13 мм, размер пор 0,2-0,4 мкм).
Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.
Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98%.
Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61 , ч.д.а.
Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.
Метанол для градиентной ВЭЖХ.
Магний сернокислый безводный, х.ч.
Кальций хлористый безводный, гранулированный, х.ч.
Хлороформ по ГОСТ 20015 , х.ч.
Толуол по ГОСТ 5789 , х.ч.
Спирт этиловый абсолютированный.
Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 29227 .
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5, 10, 25, 50, 100 и 1000 см исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770 .
Колбы остродонные вместимостью 10, 25 см.
Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Микропробирка вместимостью 100-400 мм.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250 см любого исполнения по ГОСТ 1770 .
Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см
Чашка фарфоровая диаметром 125-150 мм.
Эксикатор лабораторный вместимостью 3 дм.
Воронки лабораторные по ГОСТ 25336 .
Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100, 250 см по ГОСТ 25336 .
Стаканы химические вместимостью 10, 20, 50, 100 и 200 см по ГОСТ 25336 .
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 26313 . Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671 , ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7 Подготовка к проведению испытаний
7.1 Общие требования
Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7.2 Приготовление вспомогательных растворов
7.2.1 Приготовление подвижной фазы А
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты, 100 см метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.
Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].
7.2.3 Приготовление растворителя 1
В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.
7.3 Подготовка сернокислого магния
Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180°С - 200°С в течение 6-10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30°С - 40°С и через 2-3 мин перемешивания реакционной массы.
7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов
7.4.1 Приготовление растворов ПАТ
7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 мкг/см
Берут 2,0 мг чистого кристаллического ПАТ, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в мерной колбе вместимостью 10 см в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.
Срок хранения исходного раствора ПАТ при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 1 мес.
7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 мкг/см
Переносят 1 см полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5,0 см полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 см, затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5,0 см абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.
Массовую концентрацию ПАТ в растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ПАТ, равная 153,1 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600, м/моль.
7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 мкг/см
5 см исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200 мкг/см (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см, концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.
7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя -.
7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА
7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 мкг/см
2,0 мг чистого кристаллического ОТА, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в химическом стакане вместимостью 25 см растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.
Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 300 до 370 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.
Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ОТА, равная 402,7 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 544, м/моль.
Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более четырех лет.
7.4.2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 мкг/см
Отбирают 2,5 см исходного раствора ОТА (7.4.2.1), переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.
Срок хранения раствора ОТА при температуре 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) -.
7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА
Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые аналиты.
7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 нг/см (раствор n
-1)
1 см раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1 см стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100 мкг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 нг/см (раствор n
-2)
1 см раствора -1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов n
-1 и n
-2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 1 - Объемы растворов n
-1 и n
-2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора n
-2, см | |||||||
Объем раствора n
-1, см | |||||||
Количество введенного ПАТ, нг | |||||||
Массовая концентрация ПАТ в растворе, нг/см | |||||||
7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА
7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 нг/см (раствор A
-1)
1 см раствора ОТА концентрацией 5 мкг/см (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 см.
7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 нг/см (раствор А
-2)
0,5 см промежуточного раствора ОТА А
-1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят ацетонитрилом раствор до метки.
7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА
Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А
-1 и А
-2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 2 - Объемы растворов А
-1 и А
-2 для приготовления градуировочных растворов ОТА
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора А
-2, см | |||||||
Объем раствора А
-1, см | |||||||
Количество введенного ОТА, нг | |||||||
Массовая концентрация ОТА в растворе, нг/см | |||||||
Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.
Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10 мм приготовленных по 7.5.1.3 и 7.5.2.3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.
Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.
7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы
Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.
При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
- температура окружающего воздуха от 20°С до 25°С;
- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;
- напряжение в электросети (220±10) В;
- частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;
- относительная влажность воздуха от 40% до 80%.
7.7 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы
Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,999 (для ПАТ) и 0,965 (для ОТА), а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более ±10%.
Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5%.
8 Проведение испытаний
8.1 Экстракция
10 см () предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см. В пробирку добавляют 20 см ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех-пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000-5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5°С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (). 18-19 см () экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 см. Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40°С и немедленно перерастворяют в 1 см () ацетонитрила.
При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех-пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см и центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 3-5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пор 0,2-0,4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100-400 мм. Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10 мм приготовленной пробы.
8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов
Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ 11,2%. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030 .
Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.
8.3 Проведение измерений
8.3.1 Общие условия
Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.
ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM
с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа, прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.
Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.
8.3.2 Идентификация микотоксинов
Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микотоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго m/z
-перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.
Соотношение пиков для одного микотоксина не должно отличаться более чем на 20% от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.
9 Обработка и оформление результатов испытаний
9.1 Количественное определение
Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.
Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции , мкг/дм, рассчитывают по формуле
где - коэффициент перевода из кубических сантиметров в кубические дециметры;
- концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 мм, инжектированном в ВЭЖХ-МС/МС систему, определенное по градуировочной зависимости, нг;
- объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, см;
- общий объем экстракта, из которого отбирается для концентрирования объем , см;
- объем пробы, введенный в хроматограф (=10 мм), мм;
- объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, см;
- объем экстракта, отобранный для концентрирования, см.
При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.
За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости
где , - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, мкг/дм;
, , - результаты трех параллельных определений, мкг/дм;
- значение критического диапазона, %.
Расхождение между тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) , равного 3,6· при вероятности =0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.
Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 .
9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.
10 Метрологические характеристики
Метрологические характеристики метода для ПАТ и ОТА соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.
Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС
Диапазон измерений, мкг/дм | Относительное стандартное отклонение повторяемости , % | Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , % |
при определении ПАТ (не более) |
||
при определении ОТА (не более) |
||
Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD
- 0,03 мкг/дм, LOQ
- 0,1 мкг/дм.
11 Контроль качества результатов измерений
Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
ГОСТ 12.1.007 .
ВНИМАНИЕ!
При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным нефротоксическим, иммунотоксическим, тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации IARC
ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду, в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.
Приложение А (обязательное). Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента CF для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
Приложение А
(обязательное)
Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
А.1 Для определения массовых концентраций микотоксинов в исходных растворах (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) используют спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности растворов в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см в интервале длин волн от 200 до 400 нм.
Калибровку спектрофотометра проводят следующим образом.
Измеряют оптическую плотность трех растворов дихромата калия (KCrO) в серной кислоте (HSO) - 0,25; 0,125 и 0,0625 ммоль/дм в максимальной точке поглощения (длина волны около 350 нм), используя в качестве контроля раствор серной кислоты (HSO) концентрации 0,009 ммоль/дм.
Затем рассчитывают значение молярного коэффициента оптической плотности , м/моль, для каждой концентрации дихромата калия по формуле
где - измеренное значение оптической плотности раствора дихромата калия в серной кислоте для соответствующей концентрации, ед. ОП;
- концентрация раствора дихромата калия в серной кислоте, ммоль/дм.
Если разница между тремя полученными значениями выходит за пределы гарантированного интервала точности измерений оптической плотности , то необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование. Рассчитывают среднеарифметическое значение .
Определяют поправочный коэффициент (безразмерная величина) для конкретного оборудования (спектрофотометра и кювет) по формуле
где - характерное значение молярного коэффициента оптической плотности для растворов дихромата калия (KCrO), м/моль;
- молярный коэффициент оптической плотности, рассчитанный по формуле (А.1), м/моль.
Если полученное значение поправочного коэффициента менее 0,95 или более 1,05, то для устранения отклонений необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование (для калибровки и проверки чистоты используют один и тот же набор кювет) -.
Приложение Б (справочное). Примеры ВЭЖХ-МС/МС систем для определения микотоксинов в соках и другой соковой продукции*
Приложение Б
(справочное)
________________
* Данные примеры являются рекомендуемыми и приведены для удобства пользователей настоящего стандарта.
Б.1 ВЭЖХ-МС/МС система N 1
Аппаратная платформа: Varian 320-MS LC/MS/MS.
Ионный
Для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов проводят пробоподготовку методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах «Диапак» (п. 3.2.3). Разделение, иден-тификацию и количественное определение микотоксинов в подготовленных пробах осущест-вляют методом высокоэффекти-вной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматог-рафе серии «Милихром–5» в модульном исполнении (рис. 12).
Рис. 12. Микроколоночный хроматограф
В работе рассматривается обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ для определения патулина. Детектирование проводят на длине волны 276 нм. Для точной идентификации патулина использу-ют также многоволновое детектирование, позволяющее применить в качестве дополнительного параметра идентификации спектральные отно-шения. Разделение осуществляют в режиме градиентного элюирования, что позволяет повысить разрешающую способность и чувствительность анализа.
Рис. 13. Жидкостный хроматограф:
1 – насос; 2 – узел ввода проб; 3 – хроматографическая колонка; 4 – детектор;
5 – слив для элюата или коллектор для фракций; 6 – регистратор (самописец,
интегратор или персональный компьютер)
6
4
Анализ пробы с помощью жидкостного хроматографа (рис. 13) осуществляется следующим образом. Определенный объем раствора анализируемой пробы с помощью узла ввода проб (2) вводится в верхнюю часть хроматографической колонки (3). С помощью насоса (1) анализируемая смесь прокачивается элюентом через хроматогра-фическую колонку (3), в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные фракции (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий разделенные компоненты, анализируется детектором (4), показания которого фиксируются регистратором (6).
Методические основы ВЭЖХ
Элюотропные ряды. Элюирующей силой элюента называется способность элюента (растворителя или смеси растворителей) вытеснять адсорбат с поверхности адсорбента. При этом чем сильнее молекулы элюента адсорбируются на активных центрах сорбента, тем выше его элюирующая сила. Расположенные в ряд по возрастанию элюирующей силы растворители образуют элюотропный ряд .
В качестве элюентов для обращенно-фазовой хроматографии используются смеси растворителей, содержащие воду и органические соединения, модифицирующие элюирующую силу – н-спирты, ацетонитрил, тетрагидрофуран и другие, образующие с водой истинные растворы. В нормально-фазовой хроматографии в качестве элюентов используют полярные модификаторы – линейные и циклические углеводороды (гексан, циклогексан, гептан и др.).
Детекторы для жидкостных хроматографов. В настоящее время разработано более 20 детекторов для ВЭЖХ. Наибольшее распространение получили пять, три из которых являются оптическими, а два – электрохимическими. Эти пять детекторов позволяют анализировать все классы органических и неорганических веществ.
К оптическим детекторам относят спектрофотометрический детектор (ультрафиолетовый (УФ), работающий в волновом диапазоне
200–360 нм и видимый с волновым диапазоном 360–780 нм), флуориметрический и рефрактометрический детекторы; к электро-химическим – вольтамперометрический и кондуктометрический детекторы. Особое значение имеет масс-спектрометрический детектор, обладающий уникальной информативностью, так как позволяет проводить идентификацию хроматографически разделенных компо-нентов, используя базы данных масс-спектров веществ.
Спектрофотометрический детектор является наиболее распространенным детектором для ВЭЖХ. Принцип его действия основан на известном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера . Спектро-фотометрический детектор регистрирует спектры избира-тельного абсорбционного поглощения излучения веществом. Спектры поглощения зависят от строения исследуемого вещества. Это позволяет идентифицировать вещество по его спектру, располагая библиотекой спектров или стандартами. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность полос спектров зависит от концентрации вещества, что является основой количественного анализа, т. е. определения концентра-ции вещества.
Пусть монохроматический свет от источника интенсивностью I 0 попадает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С . Вещество способно поглощать монохроматическое излучение. Мерой способности поглощения данного монохроматического излучения служит величина ε – коэффициент молярного поглощения, или коэффициент экстинкции. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I . Согласно закону светопоглощения при длине волны λ= const
I = I 0 ∙10 -ε Cl , (7)
где I
– интенсивность светового потока после прохождения кюветы;
I
0 – интенсивность падающего светового потока; ε
– коэффициент экстин-кции; С
– молярная концентрация вещества в кювете; l
– длина кюветы.
Отношение I к I 0 , выраженное в процентах, называется пропусканием Т , а величина А=lg(I 0 / I ) – оптической плотностью.
A=lg(I 0 /I)= ε С∙ l . (8)
Оптическая плотность вещества прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества. В спектрофотометрических детекторах аналитической величиной является оптическая плотность А . Формула (8) служит основой количественного анализа при использовании спектрофотометрического детектора, так как оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика.
Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм называется ультрафиолетовым спектром поглощения (рис. 14).
200 230 260 290 320 350 λ , нм
А
, е.о.п.
Рис. 14. Ультрафиолетовый спектр поглощения водного раствора
вещества х
3.2.3. Пробоподготовка образцов
Любое вещество имеет длину волны максимального поглощения(λ , нм). При использовании данной длины волны детектор имеет наименьший порог обнаружения вещества.
С помощью спектрофотометрического детектора (СФД) детектируется большое количество веществ различных классов, поглоща-ющих ультрафиолетовый свет.
Использование спектрофотометрического детектора в хроматогра-фии значительно облегчает идентификацию. Многоволновый детектор в сочетании с программным обеспечением позволяет получить хроматограмму на нескольких длинах волн одновременно и рассчитать дополнительный параметр для идентификации компонентов – спектральное отношение (Q ) – отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн
где А 1 и А 2 – коэффициенты оптической плотности на длинах волн 1 и 2. Величина Q для каждого вещества является постоянной характеристикой и не зависит от его концентрации. Точность спектральных отношений зависит от значений оптической плотности вещества и конструкции детектора.
Пробоподготовка образцов при помощи метода твердофазной экстракции на концентрирующих патронах обеспечивает экономию временных и трудовых затрат. Твердофазная экстракция позволяет сконцентрировать пробу и очистить ее от сопутствующих примесей. Комплексная схема твердофазной экстракции предусматривает последовательное использование двух патронов:
– универсального концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» – патрона многоразового применения (до 50 проб) с набором верхних и нижних фильтров (10 шт.);
– универсального патрона для тонкой очистки «ДИАПАК С» – патрон одноразового применения.
Для подготовки концентрирующих патронов необходимо выполнить следующие операции.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» :
– прокачать через патрон 10 мл смеси вода-ацетонитрил (58:42);
– непосредственно перед проведением пробоподготовки прокачать через патрон 10 мл дистиллированной воды.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК С» :
– прокачать через патрон 5 мл бензола и заглушить патрон с обоих концов.
Подготовка пищевого продукта к концентрированию
Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и коли-чественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. В колбу внести по 6,0 мл раствора Карреза I и раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем прозрачного фильтрата П.
При подготовке осветленных соков и напитков отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 мл прозрачного фильтрата П.
Концентрирование пробы на патроне «ДИАПАК П-З»
Весь объем фильтрата П нанести на предварительно подготовленный патрон со скоростью 1–2 капли в секунду.
Промыть патрон 5 мл бидистиллированной воды, отбрасывая все смывы.
Элюировать патулин с патрона 10 мл этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 мл
1,5%-ного водного раствора карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать расслоиться.
Собрать осушительную колонку, заполнив корпус с фильтром примерно 2 г безводного сульфата натрия, уплотнить осушитель постукиванием по стенке колонки и зафиксировать ватным тампоном.
Декантировать верхний этилацетатный слой при помощи пипетки, профильтровать через осушительную колонку, собирая фильтрат в отгонную сердцевидную колбу на 50 мл; дополнительно проэкстрагировать водный раствор карбоната натрия сначала 10 мл, а затем 5 мл этилацетата и, после расслоения, последовательно профильтровать декантированные объемы этилацетата через осушительную колонку в ту же колбу.
Упарить этилацетат в вакууме при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 мл (не упаривать досуха!), добавить 2,5 мл бензола (соблюдать соотношение объемов 1:5).
Очистка пробы на патроне «ДИАПАК С»
Снять заглушки с подготовленного патрона и пропустить бензол-этилацетатный раствор пробы со скоростью 1–2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5–1,0 мл смеси бензол-этилацетат (85:15) и нанести на патрон, отбросив смывы.
Элюировать патулин с патрона 6 мл смеси бензол:этилацетат (7:3), собирая элюат в сердцевинную отгонную колбу.
Упарить элюат досуха на суховоздушной бане при температуре не более 40°С.
Немедленно! После упаривания перерастворить пробу в 0,2–0,25 мл элюента А (п. 3.2.4.2), охлажденного до 5–8°С.
3.2.4. Порядок выполнения работы
Цель работы – определение содержания микотоксина патулина в составе пищевых продуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе серии «Милихром–5».3.2.4.1. Методика измерений
Проведение измерений включает следующие основные этапы:– градуировку хроматографа по растворам с известной массовой концентрацией патулина;
– подготовку пищевой пробы методом твердофазной экстракции по пп. 3.2.3;
– анализ экстракта методом ВЭЖХ с регистрацией сигнала УФ детектором;
– идентификацию патулина по параметрам удерживания и спектральным отношениям;
– вычисление массовой концентрации патулина в пробе на основе зарегистрированного аналитического сигнала (высоты пика) и градуировочного графика;
– вычисление массовой доли патулина в составе пищевого продукта.
Приборы, реактивы и материалы, необходимые для выполнения работы:
– хроматограф серии «Милихром–5» или любой другой хроматограф для ВЭЖХ с программным обеспечением WinXrom или Мультихром;
– хроматографическая колонка для ВЭЖХ: Диасфер–110–С10СN (5 мкм, 2×80 мм, ТУ 4215–001–05451931–94);
– дозатор переменного объема на 1–100 мкл;
– дозатор переменного объема на 100–1000 мкл;
– коническая колба с плотно притертым шлифом емкостью до 10 мл;
– мембранные фильтры;
– набор стандартных растворов патулина с концентрацией – 1, 2, 5 и 10 мг/л;
– фосфорная кислота 85%-ная;
– ацетонитрил для жидкостной хроматографии (о.с.ч. ТУ 6–09–3513–86, УФ поглощение до 200 нм);
– гексан, химически чистый (ректифицированный);
– трифторуксусная кислота;
– раствор Карреза I – 15,0 г гексацианоферата II калия растворить в 100 мл воды.
– раствор Карреза II – 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 мл воды;
– элюенты А, Б и С.
Приготовление элюентов
Элюент А. В мерную колбу с плотно притертым стеклянным шлифом емкостью 100 мл вносят 20 мл ацетонитрила и 0,5 мл 10%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Раствор тщательно перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой, предварительно отфильтрованной через мембранный капроновый фильтр (0,2 мкм). Затем проводят дегазацию элюента вакуумированием в течение 1 минуты при разрежении 1кг∙с/см 2 .
Элюенты Б и С готовят также как элюент А, только на 100 мл раствора берут 10 и 0 мл ацетонитрила, соответственно.
3.2.4.2. Установка хроматографических режимов разделения
и регистрации результатов
Для проведения измерений необходимо установить рабочие режимы хроматографа.Режимы дозатора:
– регенерация – 300 мкл;
– объем пробы – 5 мкл;
– расход элюента – 150 мкл/мин;
– режимы градиентного элюирования: 800 мкл – элюента А,
500 мкл – элюента Б, 300 мкл – элюента С;
– температура термостата – 35 0 С.
Режимы детектирования:
– число длин волн – 3;
– длины волн – 250, 276, 290 нм;
– время измерения – 0,04 с.
Кондиционирование хроматографической системы осуществляют за 30 минут до проведения измерений путем выполнения «холостого» анализа, в котором стандартную смесь, содержащую патулин, заменяют 5–10 мкл элюента, а затем проводят разделение стандартной смеси микотоксинов.
Задание 1. Изучить методику пробоподготовки пищевых продуктов для определения содержания патулина. Приготовить пробы в соответствии с п. 3.2.3.
Задание 2. Провести градуировку хроматографа. Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом стандартных растворов патулина с концентрациями 1, 2, 5 и 10 мг/л.
Под руководством преподавателя предлагается с клавиатуры ПК в программу (WinXrom) ввести параметры проведения хроматографического разделения (пп. 3.2.4.3) и запустить в автоматическом режиме 2–4 хроматографических анализа. Результаты оформить в виде табл. 6.
Т а б л и ц а 6
На основе полученных хроматографических профилей построить калибровочный график (по оси ординат откладывается концентрация – мг/л, по оси абсцисс оптическая плотность микотоксина А – е.о.п.).
Задание 3. Идентифицировать в исследуемом образце пищевого продукта патулин и определить его концентрацию.
Под руководством преподавателя запустить измерение подготовленной пробы пищевого продукта в автоматическом режиме
(с параметрами хроматографического разделения, выбранными в задании 2). По окончании измерения провести идентификацию микотоксина патулина по файлу стандарта («СтандартДД–ММ–ГГ.001»), полученному в задании 2. Используя калибровочный график, построенный в задании 2, определить концентрацию патулина в пробе пищевого продукта.
Результаты занести в табл. 7.
Т а б л и ц а 7
Массовую концентрацию патулина в пробе пищевого продукта вычисляют по формуле
где С – массовая концентрация патулина в пробе, мг/л (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из значения высоты аналитического пика); V p – объем пробы, мл; R – степень извлечения микотоксина на стадии пробоподготовки (равна 60%); М пр – масса пробы пищевого продукта, использованной для очистки и последующего хроматографического определения, г.
Результат измерения массовой доли микотоксина в определяемом объекте представляют в следующем виде: Х ± мг/кг; при Р =0,95 и заносят в протокол (прил. 1), где X i , – массовая концентрация патулина в пробе, мг/кг; Р – вероятность; – граница абсолютной погрешности, вычисляемая по формуле
После получения результата необходимо оценить значения нормативов оперативного контроля сходимости, которые приведены в соответствующих ГОСТах на методы контроля (анализа).
Сделать заключение о соответствии (или несоответствии) содержания патулина в исследованном пищевом продукте допустимым уровням, установленным СанПиН 2.3.2.1078–01.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие принципы лежат в основе классификации хроматографических методов анализа?
2. В чем сущность хроматографического разделения? Как проводят качественную идентификацию и количественный анализ?
3. В каких пищевых продуктах нормируется содержание микотоксинов? Какие микотоксины определяют в составе пищевых продуктов в соответствии с требованиями СанПиН?
4. Какой хроматографический метод используют для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов?
5. На чем основано спектрофотометрическое детектирование? Что такое спектральные отношения и для чего их используют?
6. Как проводят пробоподготовку пищевых продуктов для определения содержания патулина методом ВЭЖХ?
7. Проведение каких операций включает методика определения патулина методом ВЭЖХ?
8. Что такое элюент и градиентное элюирование? Какие элюенты используют при определении патулина методом ВЭЖХ?
9. Как проводят идентификацию патулина и его количественное определение?
10. Как обеспечивается точность определения патулина методом ВЭЖХ?
